Perfusion og inflation af musens lunge for tumor histologi

Summary

Formålet med denne metode er at præsentere en enkel og effektiv metode til perfusion, inflation og fiksering af muse lunger til undersøgelse af lungetumorpatologi og evaluering af metastaser til lungerne.

Abstract

Evnen til at evaluere lunge histologi er afgørende for områderne lungekræft forskning og kræft metastaser. Det er lige så vigtigt at udføre obduktioner hurtigt og effektivt fra undersøgelser uden at ofre kvaliteten af de indkøbte væv. Målet med denne protokol er at præsentere en metode til hurtigt at gennemgå, puste og fastsætte mus lunger til downstream histologiske analyse. Denne metode standardiserer ikke lungeinflationen; således kræver det ikke nogen særlige procedurer eller udstyr og i stedet blot instills fikseringsmiddel direkte gennem luftrøret efter perfusion gennem hjertet. Dette giver mulighed for tilstrækkelig vurdering af tumor størrelse, histologi, og scoring. Dette giver også mulighed for indsamling af frosset væv forud for lungevæv fiksering. Denne metode er begrænset, idet den ikke giver mulighed for senere morfometrisk kvantificering af lungerne; Det er dog mere end tilstrækkeligt til lungetumoranalyse fra genetisk manipulerede musemodeller (GEMMs), syngeneiske modeller samt xenograft tumor- og metastaseundersøgelser.

Introduction

En række musemodeller af lunge oncogenesis og kræft metastaser til lungerne findes lige fra komplekse GEMMs til kræftfremkaldende-induceret modeller til syngeneic og xenograft modeller, hvor kræftceller injiceres via intracardiac, intrathoracic, halen vene, eller andre metoder til at etablere tumorer i lungerne. Alle disse modeller deler det fælles behov for histologisk evaluering af lunge histologi og patologi. Således er det nødvendigt at have en robust, men hurtig metode til at udføre obduktioner af mus, mens perfusing lungerne for at fjerne overskydende blod, og oppustning og fastsættelse af lungerne til klart at visualisere lunge arkitektur. Hastighed er en kritisk komponent i denne procedure, da det kan være nødvendigt at indsamle lungerne fra snesevis af mus på et enkelt tidspunkt. Denne procedure kan udføres på mindre end 6 minutter pr. Mus.

Mens denne procedure er mere end tilstrækkelig til at evaluere tumor histologi, anbefales det ikke til dem, der ønsker at udføre stereologi eller morfometriske målinger af lungerne. Sådanne målinger kræver, at lungeinflationen standardiseres, og det samme gælder beregningen af lungernes absolutte overfladeareal, absolutte volumen og alveolarstørrelse og nummer¹. Denne metode er heller ikke optimal for nogle billedbehandlingsmetoder. For eksempel kræver billeddannelse af lungerne via μCT til ex vivo morfometrisk analyse, at lungerne forbliver fyldt med luft². Når bevarelsen af luftrum og dimensioner er den primære bekymring, anbefales det at rette lungerne ved perfusion dehydreringsteknikker^3,4. En af de største bekymringer ved denne model er potentialet for brud på alveolarvæggene, der mindsker brugen i undersøgelser af emfysem; den anbefalede procedure for fiksering af lunger til undersøgelse af emfysem er dog stadig ret ens, da det anbefales at fastgøre lungerne enten ved intratracheal instillation af 10% formalin (svarende til den protokol, der er beskrevet her) under konstant væsketryk eller ved in situ-fiksering⁵.

Fordelen ved den beskrevne procedure her er, at det ikke kræver konstant væsketryk, i stedet oppuste lungerne, indtil de er fuldt udvidet, hvilket reducerer den tid, der er nødvendig for proceduren. Proceduren her beskrevet ligner de metoder, der anbefales af et oprustningsarium fra Society of Toxicologic Pathology, hvor et underudvalg blev dannet for at anbefale de bedste metoder til lungefiksering til toksikologiske undersøgelser. De fleste forskere i dette underudvalg anbefalede at fastgøre lungerne ved intratracheal instillation med en sprøjte, selvom der var forskellige anbefalinger om det tidspunkt, hvor lungen blev efterladt i^{fikseringstiden 6}. Således, mens en række metoder til lunge inflation og fiksering findes, den metode, der er beskrevet heri foreslås at være den optimale metode til hurtigt at puste og fastsætte lungerne for downstream tumor histologiske evaluering.

Protocol

Alle de metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Alabama i Birmingham. 1. Eksperimentel protokol Ofre musen ved hjælp af en godkendt IACUC metode. Her brugte vi cervikal dislokation af en mus bedøvet med 5% isoflurane. Brug en passende mus til undersøgelsen. her bruger vi en 8 uger gammel FVB-mus Brug kirurgisk saks, lav et 3,5-5 mm vandret snit midt i underlivet. Derefter indsætte kirurgi…

Representative Results

Ovenstående protokol giver mulighed for hurtig perfusion, inflation og fiksering af muse lunger. Nedenstående tal viser betydningen af hvert trin. Figur 1 viser H&E farvede lunger, der er blevet perfunderet med PBS og lunger, hvor perfusionstrinnet er sprunget over, eller lungerne ikke har perfuse korrekt. Som vist skaber overskydende blod i de dårligt perfunderede lunger mindre end ideel histologi og kan gøre det udfordrende at fuldt ud observere lungearkitektur. Fi…

Discussion

Den procedure, der er beskrevet ovenfor for perfusion, inflation og fiksering af muse lunger, er ideel til hurtig og effektiv forberedelse af muse lunger til lungetumor histologi og patologianalyse. Proceduren kræver ikke noget specielt udstyr og kan udføres på mindre end 6 minutter pr. Mus. Proceduren kræver ikke et fast volumen for inflation eller konstant væsketryk. Da denne procedure ikke er standardiseret, anbefales det ikke til dem, der ønsker at udføre stereologiske eller morfometriske analyser af lungerne….

Materials

10% buffered formalin	Fisher	23-245685
22 G Needle	BD	305155
3 mL syringe	BD	309656
70% Ethanol	Decon	2405
Forceps	Harvard Apparatus	72-8595
Heparin	Fisher	H19
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-030-CV
Surgical scissors	Harvard Apparatus	72-8428