Perfusie en inflatie van de muislong voor tumor histologie
Summary
Het doel van deze methode is om een eenvoudige en efficiënte methode voor de perfusie, inflatie en fixatie van muislongen te presenteren voor het onderzoek van longtumorpathologie en evaluatie van uitzaaiingen naar de long.
Abstract
Het vermogen om long histologie te evalueren is van cruciaal belang voor het gebied van longkankeronderzoek en kankermetastasen. Het is even belangrijk om snel en efficiënt obducties uit studies uit te voeren zonder de kwaliteit van de verkregen weefsels op te offeren. Het doel van dit protocol is om een methode te presenteren om de muizenlongen snel te doordrenken, op te blazen en te fixeren voor downstream histologische analyse. Deze methode standaardiseert de longinflatie niet; het vereist dus geen speciale procedures of apparatuur en brengt in plaats daarvan eenvoudig fixatief rechtstreeks door de luchtpijp na perfusie door het hart. Dit maakt een voldoende schatting van tumorgrootte, histologie en score mogelijk. Dit maakt het ook mogelijk om bevroren weefsel te verzamelen voorafgaand aan longweefselfixatie. Deze methode is beperkt in die zin dat het geen latere morfometrische kwantificering van de long mogelijk maakt; het is echter meer dan voldoende voor longtumoranalyse van genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEMMs), syngeneïsche modellen, evenals xenografttumor- en metastasestudies.
Introduction
Er bestaan verschillende muismodellen van longoncogenese en kankermetastase naar de long, variërend van complexe GEMMs tot kankerverwekkende modellen tot syngenetische en xenograftmodellen, waarbij kankercellen worden geïnjecteerd via intracardiac, intrathoracale, de staartader of andere methoden om tumoren in de long vast te stellen. Al deze modellen delen de gemeenschappelijke behoefte aan histologische evaluatie van long histologie en pathologie. Het is dus noodzakelijk om een robuuste maar snelle methode te hebben om obducties van muizen uit te voeren terwijl de longen worden doordrongen om overtollig bloed te verwijderen en de longen op te blazen en te fixeren om de longarchitectuur duidelijk te visualiseren. Snelheid is een cruciaal onderdeel van deze procedure, omdat het nodig kan zijn om de longen van tientallen muizen op één moment te verzamelen. Deze procedure kan in minder dan 6 minuten per muis worden uitgevoerd.
Hoewel deze procedure meer dan voldoende is voor het evalueren van tumor histologie, wordt het niet aanbevolen voor degenen die stereologie of morfometrische metingen van de longen willen uitvoeren. Dergelijke metingen vereisen dat de longinflatie wordt gestandaardiseerd, net als de berekening van het absolute oppervlak van de long, het absolute volume en de alveolaire grootte en nummer1. Deze methode is ook niet optimaal voor sommige beeldvormende benaderingen. Beeldvorming van de longen via μCT voor ex vivo morfometrische analyse vereist bijvoorbeeld dat de longen gevuld blijven met lucht2. Wanneer het behoud van de luchtruimten en de afmetingen de belangrijkste zorg zijn, wordt aanbevolen om de longen te repareren door middel van perfusie-uitdrogingstechnieken3,4. Een van de grootste zorgen van dit model is het potentieel voor rupturen van de alveolaire wanden, waardoor het gebruik ervan in studies naar emfyseem wordt verminderd; de aanbevolen procedure voor fixatie van longen voor de studie van emfyseem is echter nog steeds vrij vergelijkbaar, omdat het wordt aanbevolen om de longen te fixeren door intratracheale instillatie van 10% formaline (vergelijkbaar met het hier beschreven protocol) onder constante vloeistofdruk of door fixatie in situ5.
Het voordeel van de beschreven procedure hier is dat het geen constante vloeistofdruk vereist, in plaats daarvan de longen opblaast totdat ze volledig zijn uitgebreid, waardoor de tijd die nodig is voor de procedure wordt verminderd. De hier beschreven procedure lijkt sterk op de methoden die worden aanbevolen door een bewapeningsarium van de Society of Toxicologic Pathology, waar een subcommissie werd gevormd om de beste methoden voor longfixatie voor toxicologische studies aan te bevelen. De meerderheid van de wetenschappers binnen deze subcommissie adviseerde om de longen te repareren door intratracheale instillatie met een spuit, hoewel er verschillende aanbevelingen waren over de tijd dat de long in het fixatieve6werd achtergelaten. Hoewel er dus verschillende methoden voor longinflatie en fixatie bestaan, wordt de hierin beschreven methode voorgesteld als de optimale methode om de longen snel op te blazen en te fixeren voor histologische evaluatie van downstreamtumoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierboven beschreven procedure voor de perfusie, inflatie en fixatie van muizenlongen is ideaal voor een snelle en efficiënte voorbereiding van muislongen voor longtumor histologie en pathologie-analyse. De procedure vereist geen speciale apparatuur en kan in minder dan 6 minuten per muis worden uitgevoerd. De procedure vereist geen vast volume voor inflatie of constante vloeistofdruk. Omdat deze procedure niet gestandaardiseerd is, wordt het niet aanbevolen voor diegenen die stereologische of morfometrische analyses…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek dat in deze publicatie werd gerapporteerd, werd ondersteund door het National Center for Advancing Translational Sciences onder toekenningsnummer UL1TR003096 (MDE), National Heart, Lung en Blood Institute Predoctoral Fellowship in Lung Diseases Training Program 5T32HL134640 (MLD).
Materials
| 10% buffered formalin | Fisher | 23-245685 | |
| 22 G Needle | BD | 305155 | |
| 3 mL syringe | BD | 309656 | |
| 70% Ethanol | Decon | 2405 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | 72-8595 | |
| Heparin | Fisher | H19 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Surgical scissors | Harvard Apparatus | 72-8428 |
References
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R., Structure, A. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Vasilescu, D. M., Knudsen, L., Ochs, M., Weibel, E. R., Hoffman, E. A. Optimized murine lung preparation for detailed structural evaluation via micro-computed tomography. Journal of Applied Physiology. 112 (1), 159-166 (2012).
- Blumler, P., Acosta, R. H., Thomas-Semm, A., Reuss, S. Lung fixation for the preservation of air spaces. Experimental Lung Research. 30 (1), 73-82 (2004).
- Oldmixon, E. H., Suzuki, S., Butler, J. P., Hoppin, F. G. Perfusion dehydration fixes elastin and preserves lung air-space dimensions. Journal of Applied Physiology. 58 (1), 105-113 (1985).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Lum, H., Mitzner, W. Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage. A comparison of eleven laboratory species. American Review of Respiratory Disease. 132 (5), 1078-1083 (1985).
- Edmonds, M. D., et al. MicroRNA-31 initiates lung tumorigenesis and promotes mutant KRAS-driven lung cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (1), 349-364 (2016).
- Zhao, K., et al. Wogonin suppresses melanoma cell B16-F10 invasion and migration by inhibiting Ras-medicated pathways. PLoS One. 9 (9), 106458 (2014).
