Hæmorikompatibilitet test af blod-kontakt implantater i en Flow Loop Model efterligne humanblodgennemstrømning
Summary
Denne protokol beskriver en omfattende hæmorikompatibilitet evaluering af blod-kontakt enheder ved hjælp af laser-cut neurovaskulære implantater. En flow loop model med frisk, heparinized humant blod anvendes til at efterligne blodgennemstrømningen. Efter perfusion analyseres forskellige hæmatologiske markører og sammenlignes med de værdier, der opnås umiddelbart efter blodtapning for hæmorikompatibilitetsevaluering af de testede enheder.
Abstract
Den stigende brug af medicinsk udstyr (f.eks. vaskulære transplantater, stenter og hjertekatetre) til midlertidige eller permanente formål, der forbliver i kroppens kredsløbssystem, kræver en pålidelig og multiparametrisk tilgang, der evaluerer de mulige hæmatologiske komplikationer forårsaget af disse anordninger (dvs. aktivering og destruktion af blodkomponenter). Omfattende in vitro hæmogomikompatibilitet test af blod-kontakte implantater er det første skridt i retning af en vellykket in vivo gennemførelse. Derfor er omfattende analyse ifølge Den Internationale Standardiseringsorganisation 10993-4 (ISO 10993-4) obligatorisk før klinisk anvendelse. Den præsenterede flow loop beskriver en følsom model til at analysere den hæmostatiske ydeevne af stents (i dette tilfælde, neurovaskulære) og afsløre bivirkninger. Brugen af frisk humant fuldblod og blid blodprøvetagning er afgørende for at undgå præaktivering af blod. Blodet gennembruges gennem en hepariniseret slange, der indeholder prøveemnet, ved hjælp af en peristaltisk pumpe med en hastighed på 150 ml/min. ved 37 °C i 60 min. Før og efter perfusion, hæmatologiske markører (dvs. antallet af blodlegemer, hæmoglobin, hæmatokrit og plasmatiske markører), der angiver aktivering af leukocytter (polymorfocyon [PMN]-elastase), blodplader (β-tromboglobulin [β-TG]), koagulationssystemet (thombin-antithrombin III [TAT]) og komplementkaskade (SC5b-9) analyseres. Afslutningsvis præsenterer vi en vigtig og pålidelig model for omfattende hæmorikompatibilitetstest af stenter og andre blodkontaktenheder forud for klinisk anvendelse.
Introduction
In vivo-anvendelsen af implantater og biomaterialer, som interagerer med humant blod, kræver intens præklinisk testning med fokus på undersøgelse af forskellige markører for det hæmostatiske system. Den Internationale Standardiseringsorganisation 10993-4 (ISO 10993-4) specificerer de centrale principper for vurdering af blodkontakt (dvs. stents og vaskulære transplantater) og tager hensyn til udstyrets design, kliniske nytteværdi og nødvendige materialer1.
Humant blod er en væske, der indeholder forskellige plasmaproteiner og -celler, herunder leukocytter (hvide blodlegemer [WBCs]), erythrocytter (røde blodlegemer [RBC]), og blodplader, som udfører komplekse funktioner i den menneskelige krop2. Den direkte kontakt mellem fremmede materialer og blod kan forårsage bivirkninger, såsom aktivering af immunsystemet eller koagulationssystemet, hvilket kan føre til betændelse eller trombotiske komplikationer og alvorlige problemer efter implantation3,4,5. Derfor giver in vitro hæmogomkompatibilitetsvalidering en mulighed før implantation for at opdage og udelukke hematologiske komplikationer , der kan fremkaldes ved blods kontakt med en fremmed overflade6.
Den præsenterede flow loop model blev etableret for at vurdere hæmokompatibilitet af neurovaskulære stents og lignende enheder ved at anvende en strømningshastighed på 150 ml / min i slanger (diameter på 3,2 mm) til at efterligne cerebral flow betingelser og arterie diametre2,7. Ud over behovet for en optimal in vitro-model er blodkilden en vigtig faktor for at opnå pålidelige og uændrede resultater, når man analyserer hæmokompatibilitet af et biomateriale8. Det indsamlede blod skal anvendes umiddelbart efter prøveudtagningen for at forhindre ændringer forårsaget af langvarig opbevaring. Generelt bør der udføres en skånsom tapning af blod uden stase ved hjælp af en 21 G nål for at minimere præaktiveringen af blodplader og koagulationskaskade under blodtegning. Endvidere omfatter donorudelukkelseskriterier dem, der ryger, er gravide, er i dårlig sundhedstilstand eller har taget p-piller eller smertestillende midler i løbet af de foregående 14 dage.
Denne undersøgelse beskriver en in vitro model for den omfattende hæmokompatibilitet test af stent implantater under flow betingelser. Når man sammenligner ubestrøget med fibrin-heparin-belagte stents, resultaterne af den omfattende hæmokompatibilitet test afspejler forbedret hæmokompatibilitet af fibrin-heparin-belagte stents9. I modsætning hertil fremkalder de ubestrøget stents aktivering af koagulationskaskade, som det fremgår af en stigning i thombin-antithrombin III (TAT) koncentrationer og tab af blodpladenumre på grund af vedhæftning af blodplader til stent overflade. Samlet set anbefales det at integrere denne hæm/kompatibilitetsmodel som en præklinisk test for at påvise eventuelle bivirkninger på det hæmostatiske system, der er forårsaget af enheden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver en omfattende og pålidelig metode til hæmofikompatibilitetstest af blodkontaktende implantater i overensstemmelse med ISO 10993-4 i en forskydningsflowmodel, der efterligner blodgennemstrømningen hos mennesker. Denne undersøgelse er baseret på test af laser-cut neurovaskulære implantater, men kan udføres med en række prøver. Resultaterne viser, at denne metode muliggør en bred analyse af forskellige parametre såsom blodcelletal, forekomsten af flere hæmokompatibilitetsmark…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
For udførelsen af scanning elektron mikroskopi, takker vi Ernst Schweizer fra den del af medicinske materialer videnskab og teknologi på universitetshospitalet Tuebingen. Forskningen blev støttet af Undervisnings-, Ungdoms- og Sportsministeriet i CR under Det Nationale Bæredygtighedsprogram II (Projekt BIOCEV-FAR LQ1604) og af Det Tjekkiske Videnskabsinstituts projekt nr.
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
References
- ISO. . Biological evaluation of medical devices. , (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- . SEM Imaging of Biological Samples Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019)
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
