HämokompatibilitätSprüfung von blutverfälschten Implantaten in einem Flow Loop-Modell, das den menschlichen Blutfluss imitiert
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Hämokompatibilitätsbewertung von blutverfälssenden Geräten mit lasergeschnittenen neurovaskulären Implantaten. Ein Flow-Loop-Modell mit frischem, heparinisiertem menschlichem Blut wird angewendet, um den Blutfluss zu imitieren. Nach der Perfusion werden verschiedene hämatologische Marker analysiert und mit den direkt nach der Blutentnahme gewonnenen Werten zur Hämokompatibilitätsbewertung der getesteten Geräte verglichen.
Abstract
Der zunehmende Einsatz von Medizinprodukten (z. B. Gefäßtransplantate, Stents und Herzkatheter) für temporäre oder dauerhafte Zwecke, die im Kreislaufsystem des Körpers verbleiben, erfordert einen zuverlässigen und multiparametrischen Ansatz, der die möglichen hämatologischen Komplikationen dieser Geräte (z. B. Aktivierung und Zerstörung von Blutbestandteilen) bewertet. Umfassende In-vitro-Hämokompatibilitätstests von blutverfeinernden Implantaten sind der erste Schritt zur erfolgreichen in vivo-Implementierung. Daher ist eine umfassende Analyse nach der Internationalen Organisation für Normung 10993-4 (ISO 10993-4) vor der klinischen Anwendung obligatorisch. Die vorgestellte Durchflussschleife beschreibt ein empfindliches Modell, um die hämostatische Leistung von Stents (in diesem Fall neurovaskuläre) zu analysieren und Nebenwirkungen aufzudecken. Die Verwendung von frischem menschlichem Vollblut und sanfte Blutentnahme sind wichtig, um die Voraktivierung von Blut zu vermeiden. Das Blut wird durch einen heparinisierten Schlauch, der die Probe enthält, durch eine peristaltische Pumpe mit einer Rate von 150 ml/min bei 37 °C für 60 min durchdrungen. Vor und nach der Perfusion hämatologische Marker (d.h. Blutzellzahl, Hämoglobin, Hämatokrit und Plasmamarker), die auf die Aktivierung von Leukozyten (polymorphonukleäre [PMN]-Elastase), Thrombozyten (-Thromboglobulin [-TG]), das Gerinnungssystem (Thombin-Antithrombin III [TAT]) und die Komplementkaska (SC5b-9) hinweisen, Zusammenfassend stellen wir ein wesentliches und zuverlässiges Modell für umfangreiche Hämokompatibilitätstests von Stents und anderen blutverstigenden Geräten vor der klinischen Anwendung vor.
Introduction
Die In-vivo-Anwendung von Implantaten und Biomaterialien, die mit menschlichem Blut interagieren, erfordert intensive präklinische Tests, die sich auf die Untersuchung verschiedener Marker des hämostatischen Systems konzentrieren. Die Internationale Organisation für Normung 10993-4 (ISO 10993-4) legt die zentralen Grundsätze für die Bewertung von blutverfälschten Geräten (d. h. Stents und Gefäßtransplantaten) fest und berücksichtigt das Gerätedesign, den klinischen Nutzen und die benötigten Materialien1.
Menschliches Blut ist eine Flüssigkeit, die verschiedene Plasmaproteine und Zellen enthält, einschließlich Leukozyten (weiße Blutkörperchen [WBCs]), Erythrozyten (rote Blutkörperchen [RBCs]) und Blutplättchen, die komplexe Funktionen im menschlichen Körper ausführen2. Der direkte Kontakt von Fremdstoffen mit Blut kann schädliche Effekte verursachen, wie z. B. die Aktivierung des Immunsystems oder des Gerinnungssystems, die nach derImplantationzu Entzündungen oder thrombotischen Komplikationen und schwerwiegenden Problemen nach der Implantation 3,4,5führen können. Daher bietet die In-vitro-Hämokompatibilitätsvalidierung eine Möglichkeit vor der Implantation, hämatologische Komplikationen zu erkennen und auszuschließen, die beim Kontakt des Blutes mit einer fremden Oberfläche induziert werden können6.
Das vorgestellte Durchflussschleifenmodell wurde erstellt, um die Hämokompatibilität von neurovaskulären Stents und ähnlichen Geräten zu bewerten, indem eine Durchflussrate von 150 ml/min in Schläuchen (Durchmesser 3,2 mm) angewendet wurde, um die Bedingungen des Zerebralpareseflusses und der Arteriendurchmesser2,7nachzuahmen. Neben der Notwendigkeit eines optimalen In-vitro-Modells ist die Blutquelle ein wichtiger Faktor, um bei der Analyse der Hämokompatibilität eines Biomaterials8zuverlässige und unveränderte Ergebnisse zu erzielen. Das entnommene Blut sollte unmittelbar nach der Probenahme verwendet werden, um Veränderungen zu verhindern, die durch längere Lagerung verursacht werden. Im Allgemeinen sollte eine sanfte Blutentnahme ohne Stase mit einer 21 G Nadel durchgeführt werden, um die Voraktivierung von Blutplättchen und die Gerinnungskaskaskade während der Blutentnahme zu minimieren. Darüber hinaus umfassen die Ausschlusskriterien für Spender diejenigen, die rauchen, schwanger sind, sich in einem schlechten Gesundheitszustand befinden oder in den letzten 14 Tagen orale Kontrazeptiva oder Schmerzmittel eingenommen haben.
Diese Studie beschreibt ein In-vitro-Modell für die umfangreiche Hämokompatibilitätsprüfung von Stentimplantaten unter Strömungsbedingungen. Beim Vergleich unbeschichteter mit fibrin-heparinbeschichteten Stents spiegeln die Ergebnisse der umfassenden Hämokompatibilitätstests eine verbesserte Hämokompatibilität der fibrin-heparinbeschichteten Stents9wider. Im Gegensatz dazu induzieren die unbeschichteten Stents die Aktivierung der Gerinnungskaskade, wie eine Erhöhung der Thombin-Antithrombin-III-Konzentrationen (TAT) und der Verlust von Blutplättchenzahlen aufgrund der Adhäsion der Blutplättchen an der Stentoberfläche zeigen. Insgesamt wird empfohlen, dieses Hämokompatibilitätsmodell als präklinischen Test zu integrieren, um schädliche Auswirkungen auf das hämostatische System zu erkennen, die durch das Gerät verursacht werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine umfassende und zuverlässige Methode zur Hämokompatibilitätsprüfung von blutverstättlichen Implantaten gemäß ISO 10993-4 in einem Scherflussmodell, das den menschlichen Blutfluss imitiert. Diese Studie basiert auf der Prüfung von lasergeschnittenen neurovaskulären Implantaten, kann aber mit einer Vielzahl von Proben durchgeführt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode die breite Analyse verschiedener Parameter wie die Blutzellzahl, die Prävalenz mehrerer Häm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Für die Leistungsfähigkeit der Rasterelektronenmikroskopie danken wir Ernst Schweizer von der Fachgruppe Medizinische Materialwissenschaft und -technik des Universitätsklinikums Tübingen. Die Forschung wurde vom Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der CR im Rahmen des Nationalen Nachhaltigkeitsprogramms II (Projekt BIOCEV-FAR LQ1604) und vom Projekt Nr. 18-01163S der Tschechischen Wissenschaftsstiftung unterstützt.
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
References
- ISO. . Biological evaluation of medical devices. , (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- . SEM Imaging of Biological Samples Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019)
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
