Test di emocompatibilità degli impianti che si contattono con il sangue in un modello di flusso a ciclo continuo che imita il flusso sanguigno umano
Summary
Questo protocollo descrive una valutazione completa dell’emocompatibilità dei dispositivi di contatto con il sangue utilizzando impianti neurovascolari tagliati al laser. Un modello di ciclo di flusso con sangue umano fresco ed eparinizzato viene applicato per imitare il flusso sanguigno. Dopo la perfusione, vari marcatori ematologici vengono analizzati e confrontati con i valori ottenuti direttamente dopo la raccolta del sangue per la valutazione dell’emocompatibilità dei dispositivi testati.
Abstract
L’uso crescente di dispositivi medici (ad esempio, innesti vascolari, stent e cateteri cardiaci) per scopi temporanei o permanenti che rimangono nel sistema circolatorio del corpo richiede un approccio affidabile e multiparametrico che valuti le possibili complicanze ematologiche causate da questi dispositivi (cioè, attivazione e distruzione di componenti ematici). Il primo passo verso un’implementazione in vivo di successo è il test completo di emocompatibilità in vitro degli impianti a contatto con il sangue. Pertanto, un’analisi approfondita secondo l’Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione 10993-4 (ISO 10993-4) è obbligatoria prima dell’applicazione clinica. Il ciclo di flusso presentato descrive un modello sensibile per analizzare le prestazioni emostatiche degli stent (in questo caso, neurovascolare) e rivelare effetti negativi. L’uso di sangue fresco umano intero e di un leggero prelievo di sangue sono essenziali per evitare la preattivazione del sangue. Il sangue viene perfuso attraverso un tubo eparano contenente il campione di prova utilizzando una pompa peristaltica ad una velocità di 150 mL/min a 37 gradi centigradi per 60 min. Prima e dopo la perfusione, i marcatori ematologici (ad es. numero di cellule del sangue, emoglobulina, ematocrito e marcatori plasmatici) che indicano l’attivazione di leucociti (poliomorfonucleari [PMN]-elastassi), piastrine (tromrusbotina z -TG]), il sistema di coagulazione (thombin-antithrombin iii [TAT]), e la cascata superiore (SC5b-9) sono analizzati. In conclusione, presentiamo un modello essenziale e affidabile per test di emocompatibilità estesa di stent e altri dispositivi di contatto con il sangue prima dell’applicazione clinica.
Introduction
L’applicazione in vivo di impianti e biomateriali, che interagiscono con il sangue umano, richiede intensi test preclinici incentrati sullo studio di vari marcatori del sistema emostatico. L’Organizzazione Internazionale per la Standardizzazione 10993-4 (ISO 10993-4) specifica i principi centrali per la valutazione dei dispositivi di contatto con il sangue (cioè stent e innesti vascolari) e considera la progettazione del dispositivo, l’utilità clinica e i materiali necessari1.
Il sangue umano è un fluido che contiene varie proteine e cellule plasmatiche, tra cui leucociti (globuli bianchi [WBC]), eritrociti (globuli rossi [RBC]), e piastrine, che svolgono funzioni complesse nel corpo umano2. Il contatto diretto di materiali estranei con sangue può causare effetti negativi, come l’attivazione del sistema immunitario o coagulante, che può portare a infiammazione o complicazioni trombotiche e gravi problemi dopo l’impianto3,4,5. Pertanto, la convalida dell’emocompatibilità in vitro offre l’opportunità prima dell’impianto di rilevare ed escludere eventuali complicazioni ematologiche che possono essere indotte a contatto del sangue con una superficie estranea6.
Il modello di loop di flusso presentato è stato stabilito per valutare l’emocompatibilità di stent neurovascolari e dispositivi simili applicando una portata di 150 mL/min in tubi (diametro di 3,2 mm) per imitare le condizioni del flusso cerebrale e diametri arteriosi2,7. Oltre alla necessità di un modello in vitro ottimale, la fonte di sangue è un fattore importante per ottenere risultati affidabili e inalterati quando si analizza l’emocompatibilità di un biomateriale8. Il sangue raccolto deve essere utilizzato immediatamente dopo il campionamento per evitare cambiamenti causati da un accumulo prolungato. In generale, una delicata raccolta di sangue senza stasi utilizzando un ago da 21 G deve essere eseguita per ridurre al minimo la preattivazione delle piastrine e la cascata di coagulazione durante il prelievo del sangue. Inoltre, i criteri di esclusione dei donatori includono coloro che fumano, sono incinte, sono in cattivo stato di salute o hanno assunto contraccettivi orali o antidolorifici nei 14 giorni precedenti.
Questo studio descrive un modello in vitro per l’emocompatibilità esteso dei test di stent in condizioni di flusso. Quando si confrontano gli stent rivestiti di fibrina eparina, i risultati dei test completi di emocompatibilità riflettono una migliore emocompatibilità degli stent rivestiti di mebrina-eparina9. Al contrario, gli stent non rivestiti inducono l’attivazione della cascata di coagulazione, come dimostrato da un aumento delle concentrazioni di thombin-antitrombopina III (TAT) e dalla perdita del numero di piastrine del sangue a causa dell’adesione delle piastrine alla superficie dello stent. Nel complesso, si raccomanda di integrare questo modello di emocompatibilità come test preclinico per rilevare eventuali effetti negativi sul sistema emostatico causati dal dispositivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato descrive un metodo completo e affidabile per il test di emocompatibilità degli impianti a contatto con il sangue in conformità con ISO 10993-4 in un modello di flusso di taglio che imita il flusso sanguigno umano. Questo studio si basa sul test di impianti neurovascolari tagliati al laser, ma può essere eseguito con una varietà di campioni. I risultati dimostrano che questo metodo consente l’analisi ampia di vari parametri come il numero di cellule del sangue, la prevalenza di diversi marcato…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Per l’esecuzione della microscopia elettronica a scansione, ringraziamo Ernst Schweizer della sezione di Medical Materials Science and Technology dell’University Hospital Tuebingen. La ricerca è stata sostenuta dal Ministero dell’Istruzione, della Gioventù e dello Sport del CR nell’ambito del Programma Nazionale di Sostenibilità II (Progetto BIOCEV-FAR LQ1604) e dal progetto della Fondazione scientifica ceca n. 18-01163S.
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
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