ヒトの血流を模倣したフローループモデルにおける血液接触インプラントのヘモ適合性試験
Summary
このプロトコルは、レーザーカット神経血管インプラントを用いた血液接触装置の包括的な血溶性評価について説明する。新鮮なヘパリン化されたヒト血液を有するフローループモデルは、血流を模倣するために適用される。灌流後、種々の血液学的マーカーを分析し、試験された装置の血相適合性評価のために採血後に直接得られた値と比較する。
Abstract
体内の循環系に残る一時的または永続的な目的のために医療機器(例えば、血管移植片、ステント、心臓カテーテル)の使用が増えている場合、これらの装置によって引き起こされる可能性のある血液学的合併症(すなわち、血液成分の活性化および破壊)を評価する信頼性の高いマルチパラメトリックアプローチが必要である。血液接触インプラントの包括的なインビトロヘモ適合性試験は、生体内での実装に成功するための第一歩です。したがって、国際標準化機構10993-4(ISO 10993-4)による広範な分析は、臨床応用前に必須です。提示されたフローループは、ステント(この場合は神経血管)の止血性能を分析し、悪影響を明らかにする敏感なモデルを記述する。新鮮な人間の全血と穏やかな血液サンプリングの使用は、血液の事前活性化を避けるために不可欠です。血液は、試験検体を含むヘパリンチューブを通して、37°Cで150 mL/minの速度で60分間の蠕動ポンプを使用して浸透する。灌流の前後、血液学的マーカー(すなわち、 血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、および血漿マーカー)は、白血球(多形核[PMN]エラスターゼ)、血小板(β-トロンボグロブリン[β-TG])、凝固系(トンビンアンチトロンビンIII[TAT])、および補体カスケード(SC5b-9)の活性化を示す。結論として、我々は臨床応用前にステントおよび他の血と接触装置の広範なヘモ適合性テストのための必須で信頼できるモデルを提示する。
Introduction
ヒトの血液と相互作用するインプラントや生体材料の生体内応用には、止血システムの様々なマーカーの調査に焦点を当てた強力な前臨床試験が必要です。国際標準化機構10993-4(ISO 10993-4)は、血液接触装置(すなわち、ステントおよび血管移植片)の評価の中心原則を規定し、デバイス設計、臨床有用性、および必要な材料を考慮する。
ヒト血液は、白血球(白血球[BPC])、赤血球(赤血球[RBC])、血小板など、さまざまな形質タンパク質や細胞を含む流体であり、人体2において複雑な機能を行う。血液との異物の直接接触は、炎症または血栓性合併症および移植後の深刻な問題を引き起こす可能性がある免疫または凝固系の活性化などの副作用を引き起こす可能性があります3,4,5.したがって、in vitroのヘモ適合性検証は、移植前に、異物表面6との血液の接触時に誘発される可能性のある血液学的合併症を検出および排除する機会を提供する。
提示されたフローループモデルは、脳の流れ条件と動脈径を模倣するためにチューブ(直径3.2mmの直径)に150 mL/minの流量を適用することによって神経血管ステントおよび類似の装置の血溶性を評価するために確立された2,7。最適なin vitroモデルの必要性に加えて、血液源は生体材料のヘモ適合性を分析する際に信頼性の高い、不変の結果を得るための重要な要因である8。採取した血液は、長期保存によって生じる変化を防ぐために、サンプリング直後に使用する必要があります。一般に、血液の採取中に血小板および凝固カスケードの事前活性化を最小限に抑えるために、21G針を使用して、スタシスのない血液の穏やかな収集を行う必要があります。さらに、ドナー排除基準には、喫煙、妊娠、健康状態が悪い、または過去14日間に経口避妊薬または鎮痛剤を服用した人が含まれる。
本研究では、フロー条件下でのステントインプラントの広範なヘモ適合性試験のためのインビトロモデルについて説明する。非コーティングとフィブリンヘパリンコーティングステントを比較した場合、包括的なヘモ適合性試験の結果は、フィブリンヘパリンコーティングステント9のヘモ適合性の改善を反映している。対照的に、コーティングされていないステントは、凝固カスケードの活性化を誘導し、トンビンアンチトロンビンIII(TAT)濃度の増加およびステント表面への血小板数の接着による血小板数の損失によって示される。全体的に、この血友適合モデルを前臨床試験として統合することは、装置によって引き起こされる止血システムに対するあらゆる悪影響を検出するために推奨される。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示された議定書は人間の血流を模倣するせん断流モデルのISO 10993-4に従って血通しのインプラントのヘモ適合性テストのための包括的で信頼できる方法を記述する。この研究は、レーザーカット神経血管インプラントのテストに基づいていますが、様々なサンプルで行うことができます。この方法により、血球数、いくつかの血性適合マーカーの有病率、および血球接触後のデバイス表面?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
走査型電子顕微鏡の性能については、大学病院テュービンゲンの医学材料科学技術部門のエルンスト・シュヴァイツァーに感謝します。研究は、国家持続可能性プログラムII(プロジェクトBIOCEV-FAR LQ1604)内のCRの教育・青少年・スポーツ省とチェコ科学財団プロジェクト第18-01163Sによって支援されました。
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
References
- ISO. . Biological evaluation of medical devices. , (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- . SEM Imaging of Biological Samples Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019)
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
