Kombinere Laser Capture Microdissection og Microfluidic qPCR at analysere transskriptionelle profiler af enkelte celler: A Systems Biologi tilgang til Opioid Afhængighed
Summary
Denne protokol forklarer, hvordan man indsamler enkelte neuroner, mikroglia, og astrocytter fra den centrale kerne af amygdala med høj nøjagtighed og anatomisk specificitet ved hjælp af laser capture mikrodissection. Derudover forklarer vi vores brug af mikrofluidic RT-qPCR til at måle en delmængde af transskriptionen af disse celler.
Abstract
Dyb transskriptionel heterogenitet i anatomisk tilstødende enkelte celler tyder på, at robust vævfunktionalitet kan opnås ved cellulær fænotype mangfoldighed. Encellede forsøg med at undersøge de biologiske systemers netværksdynamik viser cellulære og vævsreaktioner på forskellige tilstande ved biologisk meningsfuld opløsning. Heri forklarer vi vores metoder til indsamling af enkelte celler fra anatomisk specifikke steder og måler nøjagtigt en delmængde af deres genekspressionsprofiler. Vi kombinerer laser capture microdissection (LCM) med mikrofluidisk omvendt transskription kvantitative polymerase kædereaktioner (RT-qPCR). Vi bruger også denne mikrofluidiske RT-qPCR platform til at måle den mikrobielle overflod af tarmindhold.
Introduction
Måling af genekspressionsprofiler for enkelte celler har vist omfattende fænotypisk heterogenitet i et væv. Denne kompleksitet har kompliceret vores forståelse af de biologiske netværk, der styrer vævsfunktionen. Vores gruppe og andre har udforsket dettefænomen i mange væv og betingelser1,2,3,4,5,6. Disse eksperimenter tyder ikke kun på, at regulering af genekspressionsnetværk ligger til grund for en sådan heterogenitet, men også at encelleopløsning afslører en kompleksitet i vævsfunktionen, som opløsning på vævsniveau ikke værdsætter. Faktisk kan blot et lille mindretal af celler reagere på en bestemt tilstand eller udfordring, men virkningen af disse celler på den samlede fysiologi kan være betydelig. Derudover kan en systembiologitilgang, der anvender multivariate metoder til højdimensionelle datasæt fra flere celletyper og væv, belyse behandlingseffekter for hele systemet.
Vi kombinerer LCM og microfluidic RT-qPCR for at opnå sådanne datasæt. Vi tager denne tilgang her i modsætning til indsamling af enkelte celler via fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og ved hjælp af RNA-sekventering (RNA-seq) til at måle deres transkription. Fordelen ved LCM i forhold til FACS er, at den nøjagtige anatomiske specificitet af enkelte celler kan dokumenteres med LCM, relativt og absolut. Yderligere, mens RNA-seq kan måle flere funktioner, RT-qPCR, microfluidic RT-qPCR er billigere og har en højere følsomhed og specificitet7.
I dette repræsentative eksperiment undersøgte vi virkningerne af opioidafhængighed og naltrexon-udfældet opioidabstinenser på rotteneuronal, mikroglia og astrocytgenekspression i den centrale kerne af amygdala (Cea) og tarmmikrofloraoverflod4. Fire behandlingsgrupper blev analyseret: 1) Placebo, 2) Morfin, 3) Naltrexon, og 4) Tilbagetrækning (Figur 1). Vi konstaterede, at opioidafhængighed ikke i væsentlig grad ændrede genekspressionen, men at opioidabstinenser induceret ekspression af inflammatoriske gener, især Tnf. Astrocytter var den mest berørte celletype. Tarmmikrobiomet blev dybt påvirket af opioidabstinenser som indikeret af et fald i Firmicutes til Bacteroides-forholdet, som er en etableret markør for tarmdysbiosis8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Encellebiologi har vist heterogeniteten af cellulære fænotyper og robustheden af vævsfunktionen. Disse resultater har givet indsigt i organiseringen af biologiske systemer på både makro- og mikroskala. Her beskriver vi kombinationen af to metoder, LCM og mikrofluidic qPCR, for at opnå encellede transkriptionom foranstaltninger, der giver anatomisk specificitet og transskriptionelle nøjagtighed til en relativt lav pris (Figur 1). Vores gruppe tager en systembiologi tilgang og ofte mål…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det arbejde, der præsenteres her, blev finansieret gennem NIH HLB U01 HL133360 tildelt JS og RV, NIDA R21 DA036372 tildelt JS og EVB, og T32 AA-007463 tildelt Jan Hoek til støtte for SJO’S.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
