Combiner la microdissection de capture laser et le QPCR microfluidique pour analyser les profils transcriptionnels des cellules uniques : une approche de biologie des systèmes à la dépendance aux opioïdes

Résumé

Ce protocole explique comment collecter des neurones uniques, des microglies et des astrocytes du noyau central de l’amygdale avec une grande précision et une spécificité anatomique à l’aide de la microdissection de capture laser. En outre, nous expliquons notre utilisation de microfluidique RT-qPCR pour mesurer un sous-ensemble du transcriptome de ces cellules.

Résumé

L’hétérogénéité transcriptionnelle profonde dans les cellules simples anatomiquement adjacentes suggère que la fonctionnalité robuste de tissu puisse être réalisée par la diversité cellulaire de phénotype. Les expériences à cellule unique qui étudient la dynamique du réseau des systèmes biologiques démontrent des réponses cellulaires et tissulaires à diverses conditions à une résolution biologiquement significative. Ici, nous expliquons nos méthodes pour recueillir des cellules uniques à partir d’endroits anatomiquement spécifiques et mesurer avec précision un sous-ensemble de leurs profils d’expression génique. Nous combinons la microdissection de capture laser (LCM) avec des réactions microfluidiques de la chaîne quantitative de polymérase de transcription inverse (RT-qPCR). Nous utilisons également cette plate-forme microfluidique RT-qPCR pour mesurer l’abondance microbienne du contenu intestinal.

Introduction

La mesure des profils d’expression génique des cellules simples a démontré une hétérogénéité phénotypique étendue dans un tissu. Cette complexité a compliqué notre compréhension des réseaux biologiques qui régissent la fonction tissulaire. Notre groupe et d’autres ont exploré ce phénomène dans de nombreux tissus et conditions^1,2,3,4,5,6. Ces expériences suggèrent non seulement que la régulation des réseaux d’expression génique sous-tend une telle hétérogénéité, mais aussi ....

Protocole

Cette étude a été réalisée conformément aux recommandations du Comité de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Thomas Jefferson et du Drexel University College of Medicine. Le protocole a été approuvé par l’Université Thomas Jefferson et le Drexel University College of Medicine IACUC.

1. Modèle animal

1. Insérez deux granules de sulfate de morphine à libération lente de 75 mg ou deux granules placebo sous-cutanée chez les rats sprague-Dawley mâles adultes.
   1. Utilisez une robe et des gants de façon appropriée pour une chirurgie stérile mineure. Raser le rat dorsum avec des tondeuses si nécessaire.

Résultats

La sélection des cellules simples a été validée visuellement et moléculairement. Visuellement, la morphologie cellulaire a été vue avant la collecte de cellules. Les cellules recueillies ont ensuite été vues à la station DE QC et la tache cellulaire des noyaux (DAPI) chevauchait la fluorescence du marqueur de sélection de cellules uniques. La figure 2A montre des images représentatives d’une diapositive avec le cerveau pré-cerveau hémisé cont.......

Discussion

La biologie unicellulaire a démontré l’hétérogénéité des phénotypes cellulaires et la robustesse de la fonction tissulaire. Ces résultats ont permis de mieux comprendre l’organisation des systèmes biologiques à la fois à des échelles macro et micro. Ici, nous décrivons la combinaison de deux méthodes, LCM et qPCR microfluidique, pour obtenir des mesures de transcriptome à cellule unique qui fournissent la spécificité anatomique et l’exactitude transcriptionnelle à un coût relativement faible(figure 1.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
20X Colorant de liaison à l’ADN	Fluidigm	100-7609	NA
2x GE Réactif de chargement de dosage	Fluidigm	85000802-R	NA
48.48 Réseau dynamique IFC pour l’expression génique	Fluidigm	BMK-M-48.48	NA
96.96 Réseau dynamique IFC pour l’expression génique	Fluidigm	BMK-M-96.96	NA
Anti-CD11&beta ; Anticorps	Genway Biotech	CCEC48	Coloration microgliale
Anti-NeuN Anticorps, clone A60	EMD Millipore	MAB377	Coloration neuronale
ArcturusXT Système de microdissection par capture laser Arcturus		NA	NA
Biomark HD	Fluidigm	NA	Plateforme RT-qPCR
Antigène sérique bovin	Sigma-Aldrich	B4287
CapSure Macro LCM Caps	ThermoFisher Scientific	LCM0211	NA
CellDirect Kit qRT-PCR en une étape	ThermoFisher Scientific	11753500	Composants de la solution
tampon DAPI	ThermoFisher Scientific	62248	Nucleus Stain
DNA Suspension Buffer	TEKnova	T0221
Exonuclease I	New Englnad BioLabs, Inc.	M0293S	NA
ExtracSure Dispositif d’extraction d’échantillons	ThermoFisher Scientific	LCM0208	NA
Fisherbrand Superfrost Plus Lames de microscope	ThermoFisher Scientific	22-037-246	Lames en verre ordinaire
GeneAmp Tube à réaction à paroi mince	ThermoFisher Scientific	N8010611
GFAP Anticorps monoclonal	ThermoFisher Scientific	A-21294	Tache astrocytaire
de chèvre anti-IgG de souris (H+L), superclonale&trade ; Anticorps secondaire recombinant, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A28175	Seconadry Anticorps
IFC Controller	Fluidigm	NA
NA RNaseOut	ThermoFisher Scientific	10777019
SsoFast EvaGreen Supermix avec Low Rox	Bio-Rad	PN 172-5211	Rox master mix
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	ThermoFisher La	11754250	contient VILO et la
protéine du gène 32	T4 New Englnad BioLabs, Inc.	M0300S	NA
Préampli TaqMan Master Mix	ThermoFisher Scientific	4391128	NA
TE Buffer	TEKnova	T0225	NA

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