Kombinere Laser Capture Microdissection og Mikrofluidic qPCR å analysere transkripsjonsprofiler av enkeltceller: En systembiologi tilnærming til opioidavhengighet
Summary
Denne protokollen forklarer hvordan man samler enkeltnevroner, mikroglia og astrocytter fra amygdalas sentrale kjerne med høy nøyaktighet og anatomisk spesifisitet ved hjelp av laserfangstmikrodisseksjon. I tillegg forklarer vi vår bruk av mikrofluidic RT-qPCR for å måle et undersett av transkripsjonen av disse cellene.
Abstract
Dyp transkripsjonsheterogenitet i anatomisk tilstøtende enkeltceller tyder på at robust vevsfunksjonalitet kan oppnås ved cellulær fenotypemangfold. Encellede eksperimenter som undersøker nettverksdynamikken i biologiske systemer viser cellulære og vevsresponser på ulike forhold ved biologisk meningsfull oppløsning. Her forklarer vi våre metoder for å samle enkeltceller fra anatomisk spesifikke steder og nøyaktig måle en undergruppe av deres genuttrykksprofiler. Vi kombinerer laserfangstmikrodisseksjon (LCM) med mikrofluidiske omvendttranskripsjon kvantitative polymerasekjedereaksjoner (RT-qPCR). Vi bruker også denne mikrofluidiske RT-qPCR-plattformen til å måle mikrobiell overflod av tarminnhold.
Introduction
Måling av genuttrykksprofilene til enkeltceller har vist omfattende fenotypisk heterogenitet i et vev. Denne kompleksiteten har komplisert vår forståelse av de biologiske nettverkene som styrer vevsfunksjonen. Vår gruppe og andre har utforsket dette fenomenet i mange vev og forhold1,2,3,4,5,6. Disse eksperimentene antyder ikke bare at regulering av genuttrykksnettverk ligger til grunn for slik heterogenitet, men også at encellede oppløsning avslører en kompleksitet i vevsfunksjonen som vevsnivåoppløsning ikke klarer å sette pris på. Faktisk kan bare et lite mindretall av celler reagere på en bestemt tilstand eller utfordring, men virkningen av disse cellene på generell fysiologi kan være betydelig. I tillegg kan en systembiologitilnærming som bruker multivariatmetoder på høydimensjonale datasett fra flere celletyper og vev belyse behandlingseffekter for hele systemet.
Vi kombinerer LCM og mikrofluidic RT-qPCR for å få slike datasett. Vi tar denne tilnærmingen her i motsetning til å samle enkeltceller via fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og ved hjelp av RNA-sekvensering (RNA-seq) for å måle transkripsjonen. Fordelen med LCM over FACS er at den nøyaktige anatomiske spesifisiteten til enkeltceller kan dokumenteres med LCM, relativt og absolutt. Videre, mens RNA-seq kan måle flere funksjoner som RT-qPCR, er mikrofluidic RT-qPCR billigere og har en høyere følsomhet og spesifisitet7.
I dette representative eksperimentet undersøkte vi effekten av opioidavhengighet og naltrekson-utfelt opioidtilbaketrekking på rottenevronal, microglia og astrocyttgenuttrykk i den sentrale kjernen i amygdala (CeA) og tarmmikrofloraoverflod4. Fire behandlingsgrupper ble analysert: 1) Placebo, 2) Morfin, 3) Naltrekson og 4) Seponering (figur 1). Vi fant at opioidavhengighet ikke vesentlig endret genuttrykk, men at opioidabstinens induserte uttrykket av inflammatoriske gener, spesielt Tnf. Astrocytter var den mest berørte celletypen. Tarmmikrobiomet ble dypt påvirket av opioidabstinens som indikert av en reduksjon i Firmicutes til Bacteroides ratio, som er en etablert markør for tarmdysbiose8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Encellede biologi har vist heterogeniteten av cellulære fenotyper og robusthet av vevsfunksjon. Disse funnene har gitt innsikt i organiseringen av biologiske systemer på både makro- og mikroskalaer. Her beskriver vi kombinasjonen av to metoder, LCM og mikrofluidic qPCR, for å oppnå encellede transkripsjonstiltak som gir anatomisk spesifisitet og transkripsjonsnøyaktighet til en relativt lav pris (figur 1). Vår gruppe tar en systembiologi tilnærming og måler ofte flere vev i samme dy…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet som presenteres her ble finansiert gjennom NIH HLB U01 HL133360 tildelt JS og RV, NIDA R21 DA036372 tildelt JS og EVB, og T32 AA-007463 tildelt Jan Hoek til støtte for SJO’s.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-48.48 | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | ThermoFisher Scientific | A-21294 | Astrocyte Stain |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclonal™ Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A28175 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | Rox master mix |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
References
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
- Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
- SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
- Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
- Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).
