In Vivo Infektion med Leishmania amazonensis att utvärdera parasit virulens i möss

Summary

Här presenterar vi ett sammanställt protokoll för att utvärdera den testninginfektion av möss med Leishmania amazonensis. Detta är en tillförlitlig metod för att studera parasitvirulens, vilket möjliggör en systemisk bild av ryggradsdjur värd svar på infektionen.

Abstract

Leishmania spp. är protozoiska parasiter som orsakar leishmaniases, sjukdomar som presenterar ett brett spektrum av kliniska manifestationer från testning till viscerala skador. För närvarande beräknas 12 miljoner människor vara smittade med Leishmania över hela världen och över 1 miljard människor lever med risk för infektion. Leishmania amazonensis är endemisk i Central-och Sydamerika och leder vanligtvis till den testningform av sjukdomen, som direkt kan visualiseras i en djurmodell. Därför är L. amazonensis stammar bra modeller för testning leishmaniasis studier eftersom de också lätt odlas in vitro. C57BL/6 möss härmar L. amazonensis-drivensjukdomprogression observerats hos människor och anses vara en av de bästa mössstammar na modell för testning leishmaniasis. I ryggradsdjur värd, dessa parasiter bebor makrofager trots försvarsmekanismer av dessa celler. Flera studier använder in vitro makrofaginfektion analyser för att utvärdera parasiten smittsamhet under olika förhållanden. In vitro-metoden är dock begränsad till ett isolerat cellsystem som bortser från organismens svar. Här sammanställer vi en in vivo-infektionsmetod som ger en systemisk fysiologisk översikt över host-parasitinteraktionen. Det detaljerade protokollet för in vivo-infektion en C57BL/6 möss med L. amazonensis består av parasitdifferentiering till infekterande amastigotes, möss fotpad testning inokulering, lesion utveckling och parasit belastning bestämning. Vi föreslår denna väletablerade metod som den mest adekvata metoden för fysiologiska studier av värden immun och metaboliska svar på testning leishmaniasis.

Introduction

Leishmaniases är världsomfattande parasitiska infektionssjukdomar som representerar viktiga utmaningar i utvecklingsländerna och erkänns som en av de viktigaste försummade tropiska sjukdomar av Världshälsoorganisationen^1,2. Leishmaniases kännetecknas av testning, slemhinnor och / eller visceral manifestationer. Testning leishmaniasis orsakas vanligtvis av L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica och L. aethiopica³. Denna form av sjukdomen är ofta självläkande hos människor på grund av induktion av skyddande cellulära immunsvar. Men den cellulära immunsvaret kan misslyckas, och sjukdomen kan utvecklas till spridas testning leishmaniasis^4,5. Det finns inget tillgängligt vaccin på grund av mångfalden bland Leishmania arter och värd genetiska bakgrunder^6,7. Behandlingsalternativen är också begränsade eftersom de flesta av de läkemedel som för närvarande finns är dyra, giftiga och/eller kan kräva långtidsbehandling^8,9. Dessutom har det förekommit rapporter om läkemedelsresistens mot tillgängliga behandlingar^10,11.

Den orsakande agenten för leishmaniases är den protozoiska parasiten Leishmania. Parasiten presenterar två distinkta morfologiska former i sin livscykel: promastigotes, den flagelerade formen som finns i sandflugor; och amastigotes, den intracellulära formen finns i parasitofforösa vacuoles av däggdjur värd makrofager^12,13. Amastigotes förmåga att invadera, överleva och replikera trots försvarsmekanismerna i ryggradsdjur värdens makrofager är föremål för många studier^14,15,16,17. Följaktligen har flera forskargrupper beskrivit in vitro makrofaginfektion analyser för att utvärdera effekterna av specifika miljöfaktorer, liksom parasit och värd gener på parasit smittsamhet. Denna analys presenterar flera fördelar, såsom förmågan att anpassa studier till ett högt genomströmningsformat, relativt kortare tidsperiod för att få resultat, och minskat antal försöksdjur offras¹⁸. Resultaten av in vitro-analyser är dock begränsade eftersom de inte alltid replikerar in vivo-studier^14,19,20,21. In vivo-analyser ger en systemisk fysiologisk översikt över host-parasitinteraktionen, som inte helt kan härmas av in vitro-analyser. Till exempel, immunologiska studier kan utföras genom immunohistochemical analyser från insamlade fotdyna vävnad sektioner eller ens från popliteal lymfkörtlar för analys av återvunna immunceller²².

Djur används ofta som en modell för mänskliga sjukdomar i biologisk och biomedicinsk forskning för att bättre förstå de underliggande fysiologiska mekanismerna för sjukdomarna²³. När det gäller leishmaniasis, rutten, platsen eller dosen av inokulering påverkar sjukdomsutfallet^24,25,26,27. Dessutom regleras känslighet och resistens mot infektionen hos människor och möss starkt av värdens och parasitens genetiska bakgrund^{4,5,22,28,29,30,31}. BALB/c möss är mycket mottagliga för L. amazonensis testning infektion, visar en snabb sjukdom progression med parasiternaspridning till lymfkörtlarna, mjälte och lever³². Eftersom sjukdomen kan utvecklas till testning metastaser, infektionen kan vara dödlig. Däremot utvecklar C57BL/6 möss ofta kroniska lesioner med ihållande parasitbelastningar i L. amazonensinfektion sa³³. Därmed l. amazonensis infektion med just denna mus arter har ansetts vara en utmärkt modell för att studera kroniska former av testning leishmaniasis hos människor, eftersom det härmar sjukdomen progression bättre än BALB / c möss infektion modell^5,34.

Därför föreslår vi att musinin vivo infektion är en användbar metod för Leishmania virulens fysiologiska studier som gäller för människors sjukdom, vilket möjliggör en systemisk bild av värd-parasit interaktion. Återbesök väletablerade analyser²², presenterar vi här en sammanställs steg-för-steg-protokoll av in vivo infektion av C57BL/6 möss med L. amazonensis som består av parasitdifferentiering i axenic amastigotes, möss footpad testning inokulering, lesion utveckling, och parasit belastning bestämning. Detta protokoll kan anpassas till andra möss stammar och Leishmania arter som orsakar testning leishmaniases. Sammanfattningsvis är den metod som presenteras här avgörande för att identifiera nyaanti-Leishmania läkemedelsmål och vacciner, liksom i fysiologiska studier av värdimmun och metaboliska svar på Leishmania infektion.

Protocol

Alla experimentella förfaranden godkändes av kommittén för djurvård och användning vid Institutet för biovetenskap vid universitetet i São Paulo (CEUA 342/2019), och genomfördes i enlighet med rekommendationerna och policyerna för vård och användning av laboratoriedjur i staten São Paulo (Lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) och den brasilianska regeringen (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Alla steg som beskrivs i avsnitten 1-5 bör utföras aseptiskt inuti laminarflödesskåp. Personlig skyddsutrustning b…

Representative Results

Leishmania protozoan parasiter finns i två utvecklingsformer under sin livscykel i ryggradslösa och ryggradslösa värdar: promastigotes, de proliferativa former som finns i lumen av den kvinnliga sandflugen; och amastigotes, de proliferativa former som finns i parasitofforösa vacuoles av däggdjurvärdceller. Promastigotes har en långsträckt kropp på ca 1,5 μm bred och 20 μm lång, med en flagellum som vanligtvis kommer från den främre änden. Amastigotes har en rundad…

Discussion

In vivo infektion analys som beskrivs i detta protokoll tillåter alla forskare att utvärdera in vivo testning leishmaniasis med tanke på värd-parasit interaktion i ett systemiskt scenario. Dessa analyser har använts av många grupper^{22,24,27,29,31,32,34,49</…}

Materials

96-well plate	Greiner bio-ne	655180	A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine	Sigma	A8626	Supplement added to M199 cell culture media
caliper	Mitutoyo	700-118-20	A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask	Corning	353014	A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge	Eppendorf	5804R	An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C	Thermo Scientific	3110	An incubator for amastigotes differentiation
ethanol	Merck	K50237083820	A disinfectant for general items
fetal bovine serum	Gibco	12657-029	Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube	Thomas Scientific	3431 E04	A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose	Synth	G1008.01.AH	Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software	GraphPad		A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin	Sigma	H-2250	Supplement added to M199 cell culture media
HEPES	Promega	H5303	Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C	Fanem	347CD	An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope	Nikon	TMS	An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane			An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet	Veco	VLFS-09	A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media	Gibco	31100-035	A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube	Axygen	MCT150C	A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette	Labsystems	F61978	A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3	Merck	6329	Supplement added to M199 cell culture media
NaOH	Sigma	S8045	Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber	HBG	2266	A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope	Nikon	E200	An optical equipament used to count parasite
parafilm	Bemis	349	A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin	Gibco	15140122	Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes	TPP	93100	A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit	Gilson	F167360	A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale	Quimis	BG2000	An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel	Solidor	10237580026	A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL	Nest	327001	A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips	Axygen		A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue	Gibco	15250-061	A dye used to count viable parasites
trypticase peptone	Merck		Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe	BD	305945	A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension