Målet med denne studien er å endre rotte ortotopisk levertransplantasjon modell for å bedre representere menneskelig levertransplantasjon og forbedre mottaker overlevelse. Den presenterte metoden gjenoppretter leverarterial tilstrømning ved å koble donorleverens vanlige leverarterie til mottakerleverens riktige leverarterie.
Rat ortotopisk levertransplantasjon (OLT) modellen er et kraftig verktøy for å studere akutt og kronisk avvisning. Det er imidlertid ikke en fullstendig representasjon av menneskelig levertransplantasjon på grunn av fravær av arteriell tilkobling. Beskrevet her er en modifisert transplantasjon prosedyre som inkluderer inkorporering av leverarterie (HA) reconnection, fører til en markert forbedring i transplantasjon utfall. Med en gjennomsnittlig levertid på 12 min og 14 s, resulterer HA-tilkobling i forbedret perfusjon av den transplanterte leveren og en økning i langsiktig mottakeroverlevelse fra 37,5% til 88,2%. Denne protokollen inkluderer bruk av 3D-trykte mansjetter og holdere for å koble portalvenen og infrarød inferior vena cava. Det kan implementeres for å studere flere aspekter av levertransplantasjon, fra immunrespons og infeksjon til tekniske aspekter av prosedyren. Ved å innlemme en enkel og praktisk metode for arteriell tilkobling ved hjelp av en mikrovaskulær teknikk, etterligner denne modifiserte rotte OLT-protokollen nøye aspekter ved menneskelig levertransplantasjon og vil tjene som en verdifull og klinisk relevant forskningsmodell.
Den globale byrden av leversykdom fortsetter å øke, med en 30% økning i leversykdomsrelaterte dødsfall fra 2005 til 20131,2. Levertransplantasjon er ofte den eneste regressen for pasienter med end-stage leversykdom. Leveren er det nest hyppigst transplanterte faste organet, og antall levertransplantasjoner utført globalt økte med 7,25% fra 2015 til 20161,2. Til tross for utbredelsen har overlevelsesraten etter transplantasjon blittstagnert 3,4,5. Den 15 år lange overlevelsesraten for pasienter rapporteres å være 53 %, og den 20-årige pasientoverlevelsesraten kan være så lav som 21 %3,5. Mens det er spennende nye immunbiologiske initiativer som kan føre til nye behandlinger og forbedrede kliniske resultater, er det ennå ikke en pålitelig liten dyremodell for å teste dem.
Rotte OLT modellen har vært mye brukt i undersøkelsen av levertransplantasjon, inkludert avvisning6,7,8,,9,10, immuntoleranse11, transplantasjon iskemi-reperfusjon skade12, immunosuppression13, og galletre skade14,15,16,17. En ulempe med modellen i sin nåværende form er imidlertid dens høye postoperative sykelighet ogdødelighet 18,19. Dette er en alvorlig ulempe som er på kant med den menneskelige operasjonen, og det kompromitterer evnen til å trekke klinisk relevante konklusjoner fra modellen20.
I tillegg kan en stor andel av denne sykelighet tilskrives en fraværende eller ufullkommen leverarterie (HA) reconnection18. Selv om et kritisk skritt i menneskelig levertransplantasjon, har tekniske vanskeligheter en tendens til å kompromittere HA-tilkobling i rotte-OLT-modellen. Som et resultat er gallekanal (BD) anastomose fast og resulterer i høye hastigheter på gallelekkasje og BD-nekrose21. Utover den høye forekomsten av gallekomplikasjoner22, endrer fravær av arteriell tilsig fysiologien til graftleveren ettertransplantasjon 23, med hypoksi i donorlevertransplantatet24 og leverskade observert i betente fliker19,25,26. Rotte OLT uten arteriell tilkobling har også en tendens til å fremme fibrose27. Rotte-OLT-protokollen beskrevet nedenfor løser disse problemene ved å innlemme et enkelt HA-rekonstruksjonstrinn med en tidligere publisert rotte-OLT-metode28, noe som resulterer i bevaring av leverparenchyma og forbedret overlevelse.
Levertransplantasjon har tre faser: (1) ekstraksjon av levertransplantaten fra donoren, (2) fremstilling av donorlevertransplantatet, og (3) utskifting av mottakerleveren med levertransplantatet. Prosedyren innebærer manipulering av fem anatomiske strukturer: suprahepatic inferior vena cava (SHVC), portal vene (PV), infrahepatisk dårligere vena cava (IHVC), leverarterie (HA) og gallegang (BD).
OLT i rotten ble først introdusert av Lee et al. ved hjelp av mikrosutur anastomose av SHVC, PV og IHVC, og en pull-through teknikk for BD29. Denne modellen ble senere forbedret gjennom bruk av to-cuff teknikken i 197930. Siden da har flere alternative teknikker blitt foreslått, med flertallet som fokuserer på venøs anastomose og bruker en to-mansjettteknikk med noen modifikasjoner31. Selv om HA anastomose har blitt beskrevet tidligere i rotte OLT-modellen ved hjelp av teknikker som mikrosutur, mansjett og intraluminale ermer26,,31,,32,,33,,34, krever disse teknikkene ofte høyt utdannede mikrokirurgiske ferdigheter, endrer rottefysiologi betydelig og hindrers av trombose og / eller gallekomplikasjoner27,35.
Videre kan valget av kirurgisk prosedyre også påvirke den anhepatiske tiden (tid fra PV-klemming til reperfusjon av graft gjennom rekonstituert PV), noe som er avgjørende for suksessen til rottelevertransplantasjon. Spesielt observeres høye overlevelsesrater med anhepatiske tider på 15-20 min36,og 30 min er den øvre grensen for suksess37,38. Derfor er målet med denne metoden å implementere en mindre invasiv og lettere adopterbar kirurgisk rotte OLT-modell som er i stand til å koble til leverarterien igjen, fremme effektiv perfusjon av den transplanterte leveren, opprettholde flyten til mottakeren gallegang, og bevare mottakerens fysiologiske tilstand.
Detaljert her er alle trinnene i denne reviderte protokollen, inkludert manipulering av cøliakistammen i donorleveren, samt bruk av 1) en 1,5 mm stent for å utføre en ekstraluminal ermet forbindelse med mottakeren riktig HA, 2) en løpende sutur for SHVC rekonstruksjon, 3) to 3D-trykte plast mansjetter for PV og IHVC rekonstruksjon39,,40, 4) en mikrovaskulær ermet reconnection for HA18,27,41 og 5) en tidligere beskrevet BD stenting teknikk28. To ekstra trinn er også inkludert: en kald spyling via PV, og et antibiotikaregime som er basert på tidligere funn17. Denne optimaliserte OLT-protokollen minimerer perioperative komplikasjoner og sykelighet og modellerer nærmere den kirurgiske driftsprosedyren som brukes i menneskelig levertransplantasjon.
Små levertransplantasjonsmodeller for dyr er viktige for å forstå transplantasjonsimmunitet og identifisere nye terapeutiske strategier32. Den ideelle lille levertransplantasjonsmodellen for dyr replikerer alle trinnene i den menneskelige prosedyren, inkludert arteriell anastomose. Det kan være utfordrende å tolke resultater fra rotte OLT-modellen, da de fleste versjoner ikke inneholder et HA-anastomosetrinn, noe som fører til høyere forekomst av komplikasjoner og sykelighet42. Noen rekonstruksjonsprosedyrer har brukt nyrearterien, som krever fjerning avnyrene 27. Denne protokollen unngår organfjerning, da det er utover det som skjer i den menneskelige prosedyren.
Arterielle rekonstruksjoner kan også utføres ved å manipulere rotte aorta31. Imidlertid krever disse metodene omfattende disseksjon og klemming av aorta. Hvis klemmetiden forlenges, vil mottakerrotten ha dårlige resultater knyttet til distal iskemi43. Hos mennesker innebærer en LT kirurgisk teknikk ligation og delingen av mottakeren gastroduodenal arterie (GDA). Imidlertid gjør de fysiologiske og anatomiske egenskapene til gnagere transplantasjon ved hjelp av denne teknikken mer fysiologisk utfordrende og kan føre til komplikasjoner (det vil si nekrose i bukspyttkjertelen oggallegangen 35 og gallelekkasje44). Den arterielle tilkoblingen i denne protokollen er ment å omgå denne utfordringen, opprettholde kanalblodstrømmen og forbedre mottakerutfallet.
Bruk av ermet og stenting teknikk for rekonstruksjon av rotte HA har blitt beskrevet tidligere27. I denne teknikken brukes en stent som guide, og arterien rekonstrueres fra donorcøliakistammen til mottakeren vanlig HA. Mottakeren felles HA blir deretter dissekert ut, og mottakeren GDA er bundet av27. Som et resultat kan blodtilførselen til den nedre delen av mottakeren BD og hodet av bukspyttkjertelen bli kompromittert. Det antas at sikkerhetssirkulasjonen til dette området ofte gir utilstrekkelig blodstrøm til gallekanalen. Denne protokollen tester for eksempel mottakeren GDA først med et mikrovaskulært klips, og deler deretter mottakerenS BD. Med GDA fastklemt blør ikke den delte BD-en. Etter fjerning av GDA-klemmen observeres rask blødning fra BD. Denne protokollen, som opprettholder god flyt til delt mottaker galle kanal, beskytter fysiologien til mottakeren levervev ved å gi tilstrekkelig leverblod perfusjon og hindre post-OLT hypoksisk leverskade.
På donorsiden settes HA-stenten inn i cøliakistammen under podepreparatet med letthet ved å lage en fra cøliakistammen, venstre magearterie og miltarterie. Stenten kan settes inn gjennom den brede åpningen, noe som er mindre vanskelig enn å prøve å sette stenten inn i cøliakistammen alene. Det har blitt funnet at 24 G er en ideell størrelse å bruke for HA-stenten. Lengden på stenten skal være 1,0-1,5 mm lang, fordi den fungerer som en åpen port for å la mottakerens riktige HA lett trekkes inn i giverens felles HA. Med nøye oppmerksomhet til hvor 10-0 ethilon suturen er plassert, vil blod som strømmer gjennom denne forbindelsen aldri berøre stenten direkte, og mottakerens riktige HA vil skjerme den fra innsiden, noe som reduserer risikoen for komplikasjoner. Viktigere, donorens HA er aldri klemt for å unngå vasospasme. Suksessen med arteriell rekonstruksjon evalueres ved å la donoren GDA være åpen. Vellykket anastomose resulterer i god blodstrøm fra donor GDA når rekonstruksjonen er fullført.
I denne protokollen, lik andre, shvc reconnection er det tregeste trinnet og til slutt dikterer varigheten av anhepatisk fase. Etter hvert som varigheten av anhepatisk tid øker, øker risikoen iskemisk skade og leverdysfunksjon45. En annen kritisk komponent i OLT rottemodeller er størrelsen på transplantatet, stentene og mansjetter. Hvis transplantatet er for lite, kan transplantatet vri eller vende, noe som hindrer de vaskulære forbindelsene. Størrelsen på stenter og mansjetter kan kreve justeringer i henhold til alder, kjønn, vekt og belastning av rotten. Størrelsen på mansjettene som brukes her ble valgt som tidligere beskrevet28, og en mansjettstørrelse som kontrolleres for rottestørrelse ble brukt. Det var ingen tegn på nød eller komplikasjoner (det vil si leveroverbelastning, ødem, ascites eller splenomegali) i oppfølgingsperioden (til dags dato: median = 133 dager etter operasjonen, minimum = 115 dager etter operasjonen, maksimum = 161 dager etter operasjonen). Videre studier for å bestemme passende størrelse på PV og IHVC for ulike rottestammer som står for både alder og kjønn er berettiget.
Denne modifiserte ROTTE-OLT-protokollen bruker 3D-trykte mansjetter for PV og IHVC, som beskrevettidligere 39,40. Eksisterende metoder for tilkobling av PV og IHVC inkluderer en mikrosutur teknikk32,mansjettteknikk 46,og mikrosutur-midlertidig skinne teknikk47. Den 3D-trykte mansjettteknikken ble valgt, siden den gjør at størrelsen på mansjetten kan standardiseres i henhold til rottestamme og er enkel å forberede og bruke. Store mengder mansjetter med samme dimensjoner kan skrives ut samtidig. Den ytre overflaten av mansjetten har to spor for å hjelpe med å feste bånd og hindre glidning. En hale er også innlemmet i mansjetten design for å tillate enklere manipulering av mansjetten. Samlet sett antas det at å innlemme 3D-trykte mansjetter fører til høye suksessrater og reproduserbarhet av OLT-prosedyren ved å forkorte anhepatisk tid. Det er fastslått at denne teknikken også forkorter den kirurgiske læringskurven.
Til slutt etablerte den beskrevne protokollen en modell som ligner mer på menneskelig levertransplantasjon ved å innlemme et arteriell tilkoblingstrinn. Denne protokollen kan tilpasses for å studere mange immunologiske og kirurgiske aspekter ved levertransplantasjon og kan tjene som en modell for å teste nye terapeutiske inngrep som er relevante for transplantasjon.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert gjennom midler fra Multi-Organ transplantasjon programmet ved UHN og støtte fra Toronto General og Toronto Western Foundation.
10-0 Ethilon | Ethicon | 2830G | 10-0 Ethilon Black 1X5" BV100-4 Taper |
10mL Syringe | BD | B302995 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
1mL Syringe | BD | B309628 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
20mL Syringe | BD | B301031 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
3D Printed Cuff for IHVC | Custom | ||
3D Printed Cuff for PV | Custom | ||
3D Printed Holder for IHVC | Custom | ||
3D Printed Holder for PV | Custom | ||
3mL Syringe | BD | B309657 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
4-0 Sofsilk | Coviden | GS-835 | Wx coded braided silk, 30", Suture 1-Needle 26 mm Length 1/2 Circle Taper Point Needle |
5-0 Monocryl | Ethicon | Y433H | Undyed Monofilament 1X27" TF |
5mL Syringe | BD | B309646 | Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable |
7-0 Silk | Teleflex Medical | 103-S | Black |
8-0 Prolene | Ethicon | 2775G | 8-0 Prolene Blue 1X24" BV130-5 EVP Double Armed |
Barraquer Micro Needle Holder Without Catch | Aesculap Surgical Instruments | FD231R | Curved 120 mm, 4 3/4″ |
Barraquer Needle Holder, Extra Fine Jaws 8.0mm, Curved With Out Lock | Rumex International Co. | 8-025T | Small Size, Titanium |
Barraquer Needle Holder, Fine Jaws 12.0mm, Curved With Out Lock | Rumex International Co. | 8-021T | Small Size, Titanium |
BD Insyte Autoguard BC 22 GA x 1.00 IN | BD Angiocath / Autoguard | 382523 | 22 G x 1.00" (0.9 mm x 25 mm) Wingless catheter, 37 mL/min |
BDPrecisionGlide Single-use Needles: Regular Bevel – Regular Wall. | BD | B305106 | PrecisionGlide stainless-steel needles with translucent, color-coded, polypropylene hubs. 22 G |
BD Precisionglide Syringe Needle 21G | BD | 305167 | Gauge 21, length 1.5 inch, hypodermic needle |
BD Precisionglide Syringe Needle 30G | BD | 305128 | Gauge 30, length 1 inch, hypodermic needle |
Betadine Solution by Purdue Products LP | Purdue Products Lp | 67618-150-17 | 10% povidone–iodine topical solution USP |
Bupivacaine Injection BP 0.5% | SteriMax Inc. | DIN:02443694 | 0.5% (100mg/20mL) |
Curved Tying Forceps | Duckworth & Kent | 2-501E | 6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 88mm |
DC Temperature Controller | FHC Inc. | 40-90-8D | |
DK Iris Scissors (Curved) | Duckworth & Kent | 1-211B | Blunt tips, cut length 4mm, tip to pivot length 11mm, round handle, length 107mm |
Ethanol, 200 proof (100%), USP, Decon Labs | Decon Labs, Inc. | 2716 | Dilute to 70% with d2H2O |
Fine Adjustable Wire Retractor | Fine Science Tools | 17004-05 | Maximum spread: 3.5cm, Depth 5cm |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Appartus Limited | 34-1040SV | |
Heparin LEO(heparin sodium) | LEO Pharma Inc. | DIN:00453811 | 10,000 i.u./10 mL |
Ice-Pak | Cryopak | FIP88016 | 4.00 in. x 7.00 in., thickness 1.50 inch |
Isoflurane United States Pharmacopeia (USP) 99.9% | Piramal Healthcare Limited | DIN: 02231929 | 250 mL, Inhalation Anesthetic, NDC 66794-017-25 |
Khaw Transconjunctival Adjustable Suture Control Forceps | Duckworth & Kent | 2-502N | 5mm highly polished tying platforms, straight shafts, flat handle, length 84mm |
Lactate Ringer's Injected USP, 1000mL | Baxter Co. | DIN: 00061085 | JB2324 |
McPherson Tying Forceps | Duckworth & Kent | 2-500E | 6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 90mm |
Metzenbaum Scissors – 14.5 cm | Fine Science Tools | 14024-14 | Straight Sharp/Blunt |
Micro Kitzmiller Clamp | Scanlan | 3003-630 | Jaw length 23mm, Length 11cm |
Microscope-Leica M525 F20 | Leica Microsystems | No catalog number | |
Non-woven Gauze Sponges | Fisherbrand | 22-028-556 | |
Olsen-Hegar with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | 15 mm cutting edge, 2mm jaw surface – 14cm |
OptixCare Eye Lube, 25gm | OptixCare | ES-KE8O-69U1 | Formerly Optixcare Surgical Eye Lubricant |
Piperacillin sodium salt | Sigma-Aldrich | P8396 | Penicillin analog |
Puritan 3" Standard Cotton Swab w/Wooden Handle | Puritan Medical Products Company LLC | 803-WC | Regular Cotton Tipped Applicator with Wooden Handle |
Round Handled Needle Holder Straight w/ Lock | Fine Science Tools | 12075-12 | Round handles allow easy fingertip adjustments – 12.5cm |
Shea Scissors Curved Blunt | Fine Science Tools | 14105-12 | Transplant scissors with light and delicate pattern – 12cm |
Stainless Steel Micro Serrefines Curved – 4mm | Fine Science Tools | 18055-06 | Jaw length 4mm, Jaw width 0.75mm, Total length 16mm, Jaw pressure 125g |
Stainless Steel Micro Serrefines Curved – 6mm | Fine Science Tools | 18055-05 | Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 17mm, Jaw pressure 100g |
Stainless Steel Micro Serrefines Straight – 6mm | Fine Science Tools | 18055-03 | Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 15mm, Jaw pressure 100g |
Surgical Platform | Custom, magnetic | ||
SurgiVet Vaporstick Anesthesia Machine | General Anesthetic Services, Inc | V7015 | |
T/Pump Localized Therapy | Stryker | TP700 Series | |
Vacuum-Pressure Pump | Barnant Co. | 400-1901 | |
Vannas Scissors with Microserrations Straight | Fine Science Tools | 15070-08 | Cutting edge: 5mm, Tip diameter: 0.1mm – 8.5cm |
Vetergesic Buprenorphine | Ceva Animal Health Ltd | NAC No.:12380352 | 0.324 mg/ml buprenorphine hydochloride Solution for Injection for Dogs and Cats |
Vetroson V-10 Bipolar Electrosurgical Unit | Summit Hill Laboratories | No catalog number |