מערכת מרב התרבות Coculture מודל ריאות קשקש התקדמות קרצינומה
Summary
מערכת מודל מבחנה פותחה כדי ללכוד שינויים אדריכליים רקמה במהלך קרצינומה של הריאות קשקש (LUSC) התקדמות ב תלת מימדי (3D) שיתוף התרבות עם סרטן הקשורים פיברותקיעות (CAFs). מערכת זו אורגאיד מספק פלטפורמה ייחודית כדי לחקור את התפקידים של שונים תא הגידול הפנימי ושינויים חיצוניים לווסת את פנוטיפים הגידול.
Abstract
גידול-משתית אינטראקציות לשחק תפקיד קריטי בפיתוח של קרצינומה של הריאות קשקש (LUSC). עם זאת, הבנת האינטראקציות הדינמיות הללו תורמות לשינויים ברקמה האדריכלית שנצפתה במהלך הפעילות המאתגרת עקב חוסר המודלים המתאימים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הדור של מודל coculture 3D באמצעות תרבות התא הראשי LUSC המכונה TUM622. תאים TUM622 הוקמו מטופל lusc נגזר מבע שתל (pdx) ויש להם את המאפיין הייחודי ליצור מבנים כמו שכבתית כאשר נזרע בתוך מטריצה קרום המרתף. אנו להדגים כי TUM622 acini בתלת-ממד coculture תכונות מפתח של האדריכלות רקמה במהלך התקדמות LUSC, כמו גם את האינטראקציות דינמי בין תאים LUSC ורכיבים של מיקרוסביבה הגידול (TME), כולל מסחטות מטריקס (ECM) והתרופות הקשורות לסרטן (CAFs). אנו להתאים את פרוטוקול 3D העיקרי שלנו culturing כדי להדגים כיצד מערכת זו יכולה להיות מנוצל עבור ניתוח שונים במורד הזרם. בסך הכל, מודל זה אורגאיד יוצר פלטפורמה עשירה ביולוגית וישימה המאפשרת לקבל תובנה לתוך תא פנימי מנגנונים חיצוניים המקדמים את השיבוש של ארכיטקטורות אפיתל במהלך התקדמות קרצינומה ויסייע החיפוש אחר מטרות טיפוליות חדשות וסמני אבחון.
Introduction
סרטן ריאות הוא הגורם המוביל לתמותה הקשורות לסרטן ברחבי העולם. קרצינומה של תאי הקשקש (LUSC), שהוא הסוג השני הנפוץ ביותר של סרטן ריאות שאינו קטן תאים (NSCLC) וחשבונות עבור כ 30% של סרטן ריאות כל, מאובחנת לעתים קרובות בשלבים מתקדמים יש פרוגנוזה גרועה1. אפשרויות טיפול עבור חולים lusc הם הצורך העיקרי קליניות שניתן לשפר על ידי הבנה טובה יותר של מנגנונים סלולריים ומולקולריים המשמש כונן lusc tumorigenesis.
כמו ברוב סוגי הסרטן האנושיים, הפתוגנזה של LUSC הוא מאופיין על ידי שיבוש של שלמות, היטב מסודרת רקמת אפיתל הרקמה2. במהלך תהליך זה, הנכון apical-בסיס תא קוטביות, תא תא ואנשי הקשר מטריקס יאבדו, המתיר צמיחה בלתי מבוקרת התנהגות פולשנית של תאים סרטניים. עכשיו זה מוערך מאוד כי תכונות ממאירות של תאים סרטניים לא יכול להיות ביטוי ללא הקשר החשוב בין תאים סרטניים המקומי שלהם מיקרוסביבה הגידול (TME)3. רכיבי מפתח ב-TME כולל מטריצה החילוץ (ECM), סרטן הקשורים פיברותקיעות (CAFs), כמו גם תאים אנדותל וחדירה תאים חיסוניים באופן פעיל הצורה של TME וכוננים tuמוריגנזה4. עם זאת, ההבנה הנוכחית שלנו כיצד תאים סרטניים ורכיבים מרכזיים אלה ב TME אינטראקציה לכונן שינויים אדריכליים במהלך LUSC התקדמות היא מוגבלת מאוד.
תרבות תלת ממדית (3D) היא כלי חשוב כדי ללמוד את הפעילות הביולוגית של שינויים פנימיים בתאים וחיצוניים בוויסות שינויי אדריכלי רקמות ברקמות נורמלי וחולה5. התרבויות תלת-ממדיות מספקות את ההקשר המבני והפונקציונלי המתאים, החסר בדרך כלל בתרבויות דו-ממדיות מסורתיות (2D). הממדים הנוספים של מערכות כאלה לחקות מקרוב יותר רקמות בvivo בהיבטים רבים של פיזיולוגיה התא והתנהגויות סלולר, כולל התפשטות, בידול, הגירה, חלבון ביטוי ותגובה לטיפול בסמים. בשנים האחרונות, המאמצים של מעבדות שונות הובילו לפיתוח של מודלים 3d מחוץ גופית עבור ריאה רגילה כמו גם nsclc6,7,8. עם זאת, מודל של קרצינומה של הריאות הקשקש שיכול ללכוד הן את שינויי הרקמה הדינמית של רקמות במהלך tuמוריגנזה, כמו גם לשלב רכיבי סטרומה מפתח לא היה זמין.
כאן, אנו מתארים את השיטות להקמת רומן תלת מימדי (3d) מערכת coculture באמצעות התאים הראשוניים pdx נגזר (נקרא TUM622) ו-כף s9,10. הן TUM622 ו-CAFs נגזרות החולה NSCLC עם גידולים הבדיל גרוע10. כאשר מוטבעים כתאים בודדים ב-ECM, אוכלוסיית משנה נדירה של תאי TUM622 מעניקה את היכולת ליצור אורגנואידים עם מבנים דמויי-שכבתית המציגים קוטביות מתאימה של תא בסיס-apical. אלה מבנים כמו שכבתית הם hyperplastic, להציג ביטוי הטרוגנית של גזע כמו סמנים בידול דומה לגידול המקורי תוך שנותר לא פולשני, ובכך לחקות את השלב המוקדם ביותר של פיתוח LUSC. חשוב מכך, הראנו כי הארכיטקטורה רקמות של מבנים כמו שכבתית יכול להיות שונה על ידי עיכוב של תא-פנימי איתות מסלולים עם מעכבי מולקולה קטנה או תוספת של רכיבי מפתח ECM כגון CAFs, האחרון אשר מגביר את היווצרות acinar ועוד מעוררת acinar להיות פולשנית כאשר בסמיכות. יחד, נתונים אלה מראים כי מערכת זו שיתוף התרבות התלת-ממד של LUSC אורגנואידים מספק פלטפורמה רבת ערך עבור החקירה של הדדיות דינמי בין תאים LUSC ו TME יכול להיות מותאם עבור ניטור התגובה של תאי LUSC לטיפול בסמים11.
Protocol
Representative Results
Discussion
גידולים הם רקמות הטרוגנית מורכב של תאים סרטניים הקיימים זה לצד זה עם תאים סטרומה כגון סרטן הקשורים פיברותקיעות, תאים אנדותל ותאים חיסוניים בתוך ECM. יחד, אלה רכיבים מגוונים לחצות לדבר ולהשפיע על מיקרוסביבה הגידול, משחק תפקיד פעיל בנהיגה tuמוריגנזה, תהליך הכרוך שינויים מתקדמים בארכיטקטורת ה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לmagali Guffroy, ג ‘ ון קרגר, ו סטפן Bisulco של הקבוצה פייזר-אונקולוגיה היסטואטולוגיה וקבוצת ביוארקר לתמיכה פתולוגיה/היסטולוגיה ומייקל ארסמן לסקירה קריטית של כתב היד. אנו גם מודים לתוכנית הפוסט-דוקטורט ולקבוצה האונקולוגית R & D, במיוחד רוברט אברהם, פוג’ה סאפרה, קארן וויבין וג טג’דה על תמיכתם בתוכנית.
Materials
| Bronchial Epithelial Growth Medium | Lonza | CC-3170 | BEGM |
| Cell Strainer 40um | ThermoFisher | 352340 | For passing TUM622 cells |
| Cleaved Caspase 3 antibody | Cell Signaling Technology | 9661 (RRID:AB_2341188) | Rabbit |
| CoolRack CFT30 | Biocision | BCS-138 | For 3D culture |
| CoolSink XT96F | Biocision | BCS-536 | For 3D culture |
| Cultrex 3D Cell Harvesting Kit | Bio-Techne | 3448-020-K | |
| Cultrex (preferred for co-culture) | Bio-Techne | 3443-005-01 | For 3D culture |
| CXCR4 antibody | Abcam | Ab124824 (RRID:AB_10975635) | Rabbit |
| E-cadherin antibody | BD Biosciences | 610182 (RRID:AB_397581) | Mouse |
| GelCount | Oxford Optronix | For Acini counts and measurements | |
| GM130 antibody | BD Biosciences | 610822 (RRID:AB_398141) | Mouse |
| Goat Serum | Vector Labs | S1000 (RRID:AB_2336615) | For Immunofluorescence |
| Heat-inactivated FBS | Gibco | 10082-147 | For CAFs |
| Histology sample gel | Richard Allan Scientific | HG-4000-012 | For Immunofluorescence |
| Integrin alpha 6 antibody | Millipore Sigma | Mab1378 (RRID:AB_2128317) | Rat |
| Involucrin antibody | Abcam | Ab68 (RRID:AB_305656) | Mouse |
| Ki67 antibody | Abcam | Ab15580 (RRID:AB_443209) | Rabbit |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155379 (2) | For 3D culture |
| Lab-Tec II chambered #1.5 German Coverglass System | Nalge Nunc International | 155409 (8) | For 3D culture |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | For CAFs |
| Matrigel (preferred for mono-culture) | Corning | 356231 | For 3D culture |
| p63 antibody | Cell Signaling Technology | 13109 (SRRID:AB_2637091) | Rabbit |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For CAFs |
| ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | For TUM622 cell dissociation |
| RPMI | ThermoFisher | 11875-093 | For CAFs |
| Sox2 antibody | Cell Signaling Technology | 3579 (RRID:AB_2195767) | Rabbit |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | For CAF dissociation |
| Vi-Cell | Bechman Coulter | Automatic cell counter | |
| Vimentin antibody | Abcam | Ab92547 (RRID:AB_10562134) | Rabbit |
| β-catenin antibody | Cell Signaling Technology | 2677s (RRID:AB_1030943) | Mouse |
References
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
- Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
- Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour–stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
- Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Recherche en cancérologie. 71 (12), 4236-4246 (2011).
- Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989 (2008).
