Multiplexed enkelt celle mRNA sekvensering analyse af mus embryonale celler
Summary
Her præsenterede vi en multiplexed enkelt celle mRNA sekvensering metode til profil genekspression i mus embryonale væv. Den droplet-baserede enkelt celle mRNA sekventering (scrna-SEQ) metode i kombination med multiplexing strategier kan profilere enkeltceller fra flere prøver samtidigt, hvilket reducerer reagens omkostningerne betydeligt og minimerer eksperimentelle batch effekter.
Abstract
Enkelt celle mRNA sekventering har gjort betydelige fremskridt i de sidste mange år og er blevet et vigtigt redskab inden for udviklingsmæssige biologi. Det er blevet brugt med succes til at identificere sjældne cellepopulationer, opdage nye markørgener, og afkode rumlige og tidsmæssige udviklingsmæssige oplysninger. Den enkelt celle metode har også udviklet sig fra den mikrofluidisk baseret fluidigm C1-teknologi til de droplet-baserede løsninger i de sidste to til tre år. Her brugte vi hjertet som et eksempel til at demonstrere, hvordan man profilere mus embryonale vævsceller ved hjælp af dråbe baseret scRNA-SEQ metode. Derudover har vi integreret to strategier i arbejdsprocessen for at profilere flere prøver i et enkelt eksperiment. Ved hjælp af en af de integrerede metoder, vi har samtidig profileret mere end 9.000 celler fra otte hjerte prøver. Disse metoder vil være værdifulde for udviklingsbiologi felt ved at give en omkostningseffektivmåde at samtidig profilere enkeltceller fra forskellige genetiske baggrunde, udviklingsmæssige stadier, eller anatomiske steder.
Introduction
Den transkriptionelle profil af hver enkelt celle varierer blandt cellepopulationer under fosterudviklingen. Selv om en enkelt Molekylær in situ-hybridisering kan bruges til at visualisere et lille antal gener1, giver enkelt celle mRNA-sekventering (scrna-SEQ) en upartisk tilgang til at illustrere Genome-dækkende udtryks mønstre af gener i enkeltceller. Efter at det først blev offentliggjort i 20092, er scrna-SEQ blevet anvendt til at studere flere væv på flere udviklingsmæssige stadier i de seneste år3,4,5. Også, som den menneskelige celle Atlas har lanceret sine udviklingsorienterede projekter for nylig, mere enkelt celledata fra humane embryonale væv forventes at blive genereret i den nærmeste fremtid.
Hjertet som det første organ til at udvikle spiller en afgørende rolle i fosterudviklingen. Hjertet består af flere celletyper og udviklingen af hver celletype er stramt reguleret tidsmæssigt og rumligt. I løbet af de sidste par år, oprindelse og celle Lineage af hjerte celler på tidlige udviklingsmæssige stadier har været karakteriseret6, som giver en enorm nyttig navigation værktøj til at forstå medfødt hjertesygdomme patogenese, samt for at udvikle mere teknologisk avancerede metoder til at stimulere kardiomyocyte Regeneration7.
Scrna-SEQ har gennemgået en hurtig ekspansion i de seneste år8,9,10. Med de nyudviklede metoder er design og analyse af enkelt celle eksperimenter blevet mere opnåelige11,12,13,14. Den metode, der præsenteres her, er en kommerciel procedure baseret på dråbe opløsninger (Se tabel over materialer)15,16. Denne metode har indfangning af celler og sæt af unikt barkodede perler i en olie-vand emulsion dråbe under kontrol af et mikrofluidisk controller system. Hastigheden af celle indlæsning i dråberne er ekstremt lav, så størstedelen af dråbe emulsioner indeholder kun én celle17. Procedurens geniale design kommer fra enkelt celleseparation til dråbe emulsioner, der opstår samtidig med barkodning, hvilket muliggør parallel analyse af individuelle celler ved hjælp af RNA-SEQ på en heterogen population.
Inkorporering af multiplexing strategier er en af de vigtige Tilføjelser til den traditionelle enkelt celle workflow13,14. Denne tilføjelse er meget nyttig i kassere celle doublets, reducere eksperimentelle omkostninger, og eliminere batch effekter18,19. En lipid-baseret barkodnings strategi og en antistof baseret barkodnings strategi (Se tabel over materialer) er de to mest anvendte multiplexing metoder. Specifikke stregkoder bruges til at mærke hver prøve i begge metoder, og de mærkede prøver blandes derefter for enkelt celle optagelse, biblioteks forberedelse og sekvensering. Bagefter kan de samlede sekvensering data adskilles ved at analysere stregkode sekvenser (figur 1)19. Der er dog betydelige forskelle mellem de to metoder. Den lipid-baserede barkodnings strategi er baseret på lipid-modificerede oligonukleotider, som ikke er blevet fundet at have nogen celletype præferencer. Mens antistof baseret barkodnings strategi kun kan detektere cellerne, som udtrykker antigen proteiner19,20. Derudover tager det ca. 10 minutter at plette lipiderne, men 40 min for at plette antistofferne (figur 1). Desuden er de lipid-modificerede oligonukleotider billigere end antistof-konjugeret oligonukleotider, men ikke kommercielt tilgængelige på tidspunktet for skrivning af denne artikel. Endelig, den lipid-baserede strategi kan multiplex 96 prøver i et eksperiment, men den antistof-baserede strategi i øjeblikket kun kan multiplex 12 prøver.
Det anbefalede celle nummer til multiplex i et enkelt eksperiment bør være lavere end 2,5 x 104, ellers vil det føre til en høj procentdel af celle form og potentiel omgivende mRNA-kontaminering. Gennem multiplexing strategier, omkostningerne ved enkelt celle indfangning, cDNA generation, og bibliotek forberedelse til flere prøver vil blive reduceret til omkostningerne ved en prøve, men sekventering omkostninger vil forblive den samme.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse har vi demonstreret en protokol til at analysere enkelt celle transkriptionelle profiler. Vi har også givet to fakultative metoder til multiplex-prøver i arbejdsgangen for scRNA-SEQ. Begge metoder har vist sig at være gennemførlige på forskellige laboratorier og leverede løsninger til at køre en omkostningseffektiv og batch effekt-gratis enkelt celle eksperiment18,26.
Der er et par skridt, der bør følges …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker David M. Patterson og Christopher S. McGinnis fra Dr. ZEV J. gartner Lab for deres slags levering af de lipid-baserede barkodnings reagenser og forslag til eksperimentelle trin og dataanalyse. Dette arbejde blev grundlagt af National Institutes of Health (HL13347202).
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
- Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
- Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
- Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
- Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
- The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
- Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
- Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
- . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
- . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
- . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
- Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
- . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)
