Multiplexed single cell mRNA sequentieanalyse van embryonale cellen van de muis
Summary
Hier presenteerden we een multiplexed single cell mRNA sequencing methode om het profiel van genexpressie in de muis embryonale weefsels. De op droplet gebaseerde enkelvoudige cel mRNA-sequencing (scRNA-SEQ) methode in combinatie met multiplexing strategieën kan afzonderlijke cellen van meerdere monsters tegelijkertijd profiel, wat de kosten van de reagens aanzienlijk verlaagt en experimentele batch-effecten minimaliseert.
Abstract
Enkelvoudige cel mRNA-sequencing heeft in de afgelopen jaren aanzienlijke vooruitgang geboekt en is uitgegroeid tot een belangrijk instrument op het gebied van ontwikkelingsbiologie. Het is met succes gebruikt om zeldzame celpopulaties te identificeren, nieuwe marker genen te ontdekken en ruimtelijke en temporele ontwikkelings informatie te decoderen. De methode met één cel is ook geëvolueerd van de microfluïdische gebaseerde Fluidigm C1-technologie naar de droplet-gebaseerde oplossingen in de laatste twee tot drie jaar. Hier gebruikten we het hart als een voorbeeld om te laten zien hoe de muis embryonale weefselcellen te profiel met behulp van de druppel gebaseerde scRNA-SEQ methode. Daarnaast hebben we twee strategieën geïntegreerd in de workflow voor het profiel van meerdere samples in één experiment. Met behulp van een van de geïntegreerde methoden, hebben we gelijktijdig meer dan 9.000 cellen geprofileerd uit acht hart monsters. Deze methoden zullen waardevol zijn voor het ontwikkelingsbiologie veld door een kosteneffectieve manier te bieden om afzonderlijke cellen tegelijkertijd te Profiel van verschillende genetische achtergronden, ontwikkelingsstadia of anatomische locaties.
Introduction
Het transcriptionele profiel van elke afzonderlijke cel varieert tussen de celpopulaties tijdens de embryonale ontwikkeling. Hoewel enkelvoudige moleculaire in-situ hybridisatie kan worden gebruikt om de uitdrukking van een klein aantal genen1te visualiseren, biedt een enkelvoudige cel mRNA-sequencing (Scrna-SEQ) een onpartijdige benadering om genoom-brede expressie patronen van genen in afzonderlijke cellen te illustreren. Nadat het voor het eerst werd gepubliceerd in 20092, is scrna-SEQ toegepast om meerdere weefsels te bestuderen in meerdere ontwikkelingsstadia in de laatste jaren3,4,5. Ook, omdat de Human Cell Atlas onlangs zijn ontwikkelingsgerichte projecten heeft gelanceerd, worden er in de nabije toekomst meer enkelvoudige celgegevens van menselijke embryonale weefsels naar verwachting gegenereerd.
Het hart als het eerste orgel om te ontwikkelen speelt een cruciale rol in de embryonale ontwikkeling. Het hart bestaat uit meerdere celtypen en de ontwikkeling van elk celtype is strak gereguleerd, tijdelijk en ruimtelijk. In de afgelopen jaren, de oorsprong en celafstamming van cardiale cellen in vroege ontwikkelingsstadia zijn gekenmerkt6, die bieden een enorme nuttige navigatie tool voor het begrijpen van aangeboren hart-en vaatziekten pathogenese, evenals voor het ontwikkelen van meer technologisch geavanceerde methoden te stimuleren hartspier regeneratie7.
De scrna-SEQ heeft de laatste jaren8,9,10een snelle expansie ondergaan. Met de nieuw ontwikkelde methodes is het ontwerp en de analyse van eencellige experimenten meer haalbaar geworden11,12,13,14. De hier gepresenteerde methode is een commerciële procedure gebaseerd op de druppel oplossingen (Zie tabel met materialen)15,16. Deze methode is voorzien van het vastleggen van cellen en sets van unieke met kralen in een olie-water emulsie druppel onder controle van een microfluïdisch controller systeem. De snelheid van het laden van cellen in de druppels is extreem laag, zodat de meerderheid van de druppel emulsies slechts één cel17bevatten. Het ingenieuze ontwerp van de procedure komt van scheiding van één cel tot druppel emulsies die gelijktijdig met barcoding plaatsvinden, waardoor de parallelle analyse van afzonderlijke cellen met behulp van RNA-SEQ op een heterogene populatie mogelijk is.
De integratie van multiplexing strategieën is een van de belangrijke toevoegingen aan de traditionele single cell workflow13,14. Deze toevoeging is zeer nuttig bij het verwijderen van celdubbeltjes, het reduceren van experimentele kosten en het elimineren van batch-effecten18,19. Een lipide-gebaseerde barcoding strategie en een antilichaam gebaseerde barcoding strategie (Zie tabel van de materialen) zijn de twee meest gebruikte multiplexing methoden. Specifieke streepjescodes worden gebruikt om elk monster in beide methoden te labelen, en de gelabelde voorbeelden worden vervolgens gemengd voor het vastleggen van één cel, het voorbereiden van bibliotheken en sequentiëren. Daarna kunnen de verzamelde sequentie gegevens worden gescheiden door de barcode sequenties te analyseren (Figuur 1)19. Er bestaan echter aanzienlijke verschillen tussen de twee methoden. De lipide-gebaseerde barcoding strategie is gebaseerd op lipide-gemodificeerde oligonucleotiden, die niet is gebleken dat een voorkeuren voor het celtype. Terwijl de op antilichamen gebaseerde barcoderende strategie alleen de cellen kan detecteren die de antigeen-eiwitten19,20uitdrukken. Bovendien duurt het ongeveer 10 minuten om de lipiden te vlekken, maar 40 min om de antilichamen te vlekken (Figuur 1). Bovendien zijn de lipide-gemodificeerde oligonucleotiden goedkoper dan antilichamen-geconjugeerde oligonucleotiden, maar niet commercieel beschikbaar op het moment van schrijven van dit artikel. Tot slot, de lipide-gebaseerde strategie kan multiplex 96 monsters in één experiment, maar de antilichaam gebaseerde strategie kan momenteel alleen multiplex 12 monsters.
Het aanbevolen celnummer voor multiplex in een enkel experiment moet lager zijn dan 2,5 x 104, anders zal het leiden tot een hoog percentage van celdubbeltjes en potentiële omgevings-mRNA besmetting. Door middel van de multiplexing strategieën, de kosten van het vastleggen van één cel, cDNA generatie en bibliotheek voorbereiding voor meerdere monsters worden gereduceerd tot de kosten van één steekproef, maar de sequentiëren kosten blijft hetzelfde.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie hebben we een protocol getoond om transcriptionele profielen van één cel te analyseren. We hebben ook twee optionele methoden beschikbaar gesteld voor het multiplex van samples in de scRNA-SEQ-workflow. Beide methoden zijn haalbaar gebleken bij verschillende laboratoria en aangeboden oplossingen voor het uitvoeren van een kostenbesparend en batch-effect-vrije eencellige experiment18,26.
Er zijn een paar stappen die zor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken David M. Patterson en Christopher S. McGinnis van Dr. Zev J. Gartner Lab voor hun vriendelijke aanbod van de op lipide gebaseerde barcoderende reagentia en suggesties voor de experimentele stappen en data-analyse. Dit werk werd opgericht door de National Institutes of Health (HL13347202).
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
- Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
- Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
- Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
- Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
- The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
- Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
- Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
- . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
- . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
- . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
- Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
- . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)
