माउस भ्रूण कोशिकाओं के मल्टीप्लेक्स एकल सेल mRNA अनुक्रमण विश्लेषण
Summary
यहां हमने माउस भ्रूणीय ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति को प्रोफाइल करने के लिए एक मल्टीप्लेक्स एकल कोशिका एमआरएनए अनुक्रमण विधि प्रस्तुत की। मल्टीप्लेक्सिंग रणनीतियों के संयोजन में ड्रॉपलेट-आधारित एकल सेल एमआरएनए अनुक्रमण (स्क्आरएनए-एसईक्यू) विधि एक साथ कई नमूनों से एकल कोशिकाओं को प्रोफाइल कर सकती है, जो अभिकर्मक लागत को काफी कम करती है और प्रयोगात्मक बैच प्रभावों को कम करती है।
Abstract
एकल सेल एमआरएनए अनुक्रमण ने पिछले कई वर्षों में महत्वपूर्ण प्रगति की है और विकासात्मक जीव विज्ञान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है। इसका उपयोग दुर्लभ कोशिका आबादी की पहचान करने, उपन्यास मार्कर जीन की खोज करने और स्थानिक और लौकिक विकासात्मक जानकारी को डिकोड करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। सिंगल सेल मेथड भी पिछले दो से तीन साल में माइक्रोफ्लूइडिक बेस्ड फ्लूइडिकसीजीएम सी1 तकनीक से लेकर ड्रॉपलेट बेस्ड सॉल्यूशंस तक विकसित हुई है । यहां हमने दिल का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि बूंद आधारित स्क्आरएनए-सीक्यू विधि का उपयोग करके माउस भ्रूणीय ऊतक कोशिकाओं को कैसे प्रोफ़ाइल करें। इसके अलावा, हमने एक ही प्रयोग में कई नमूनों को प्रोफाइल करने के लिए कार्यप्रवाह में दो रणनीतियों को एकीकृत किया है। एकीकृत तरीकों में से एक का उपयोग करना, हम एक साथ आठ दिल के नमूनों से अधिक ९,००० कोशिकाओं प्रोफाइल है । ये विधियां विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि, विकासात्मक चरणों या शारीरिक स्थानों से एकल कोशिकाओं को एक साथ प्रोफाइल करने के लिए एक लागत प्रभावी तरीका प्रदान करके विकासात्मक जीव विज्ञान क्षेत्र के लिए मूल्यवान होंगी।
Introduction
भ्रूण विकास के दौरान प्रत्येक एकल कोशिका का प्रतिलेखन प्रोफ़ाइल कोशिका आबादी के बीच भिन्न होता है। यद्यपि सीटू संकरण में एकल आणविक का उपयोग कम संख्या में जीन1की अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है, एकल कोशिका एमआरएनए अनुक्रमण (स्क्आरएनए-एसईक्यू) एकल कोशिकाओं में जीन के जीनोम-व्यापी अभिव्यक्ति पैटर्न को समझाने के लिए एक निष्पक्ष दृष्टिकोण प्रदान करता है। 20092में पहली बार प्रकाशित होने के बाद, स्आरएनए -एसईक्यू को हाल केवर्षों3 ,4,5में कई विकासात्मक चरणों में कई ऊतकों का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है । इसके अलावा, जैसा कि मानव सेल एटलस ने हाल ही में अपनी विकास केंद्रित परियोजनाओं को शुरू किया है, निकट भविष्य में मानव भ्रूणीय ऊतकों से अधिक एकल कोशिका डेटा उत्पन्न होने की उम्मीद है ।
विकसित करने के लिए पहले अंग के रूप में दिल भ्रूण के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । दिल में कई कोशिका प्रकार होते हैं और प्रत्येक कोशिका प्रकार का विकास कसकर अस्थायी और स्थानिक रूप से विनियमित होता है। पिछले कुछ वर्षों में, प्रारंभिक विकासात्मक चरणों में हृदय कोशिकाओं की उत्पत्ति और सेल वंशको 6विशेषता दी गई है, जो जन्मजात हृदय रोग रोगजनकता को समझने के लिए एक जबरदस्त उपयोगी नेविगेशन उपकरण प्रदान करता है, साथ ही कार्डियोमायोसाइट पुनर्जनन7को प्रोत्साहित करने के लिए अधिक तकनीकी रूप से उन्नत तरीकों को विकसित करने के लिए।
हाल केवर्षोंमें 8,9,10में स्क्रैन -एसईक्यू का तेजी से विस्तार हुआ है . नव विकसित तरीकों के साथ, एकल कोशिका प्रयोगों का डिजाइन और विश्लेषण11, 12 ,13,14अधिक प्राप्त हो गया है। यहां प्रस्तुत विधि बूंद समाधानों (सामग्री की तालिकादेखें)15,16पर आधारित एक वाणिज्यिक प्रक्रिया है । इस विधि में माइक्रोफ्लूइडिक नियंत्रक प्रणाली के नियंत्रण में तेल-पानी पायस ड्रॉपलेट में विशिष्ट बारकोड किए गए मोतियों की कोशिकाओं और सेटों को कैप्चर करने की सुविधा है। बूंदों में सेल लोड करने की दर बहुत कम है ताकि अधिकांश बूंदों के पायस में केवल एक कोशिका17हो । प्रक्रिया का सरल डिजाइन एकल सेल पृथक्करण से बारकोडिंग के साथ एक साथ होने वाले बूंद पायस में आता है, जो विषम आबादी पर आरएनए-सीक्यू का उपयोग करके व्यक्तिगत कोशिकाओं के समानांतर विश्लेषण को सक्षम बनाता है।
मल्टीप्लेक्सिंग रणनीतियों का समावेश पारंपरिक एकल सेल कार्यप्रवाह13,14के लिए महत्वपूर्ण परिवर्धन में से एक है । यह अतिरिक्त सेल डबल्स को त्यागने, प्रायोगिक लागत को कम करने और बैच प्रभाव18,19को नष्ट करने में बहुत उपयोगी है। एक लिपिड आधारित बारकोडिंग रणनीति और एक एंटीबॉडी आधारित बारकोडिंग रणनीति (सामग्री की तालिकादेखें) दो ज्यादातर उपयोग किए जाने वाले मल्टीप्लेक्सिंग विधियां हैं। दोनों तरीकों से प्रत्येक नमूने को लेबल करने के लिए विशिष्ट बारकोड का उपयोग किया जाता है, और लेबल किए गए नमूनों को एकल सेल कैप्चरिंग, पुस्तकालय तैयार करने और अनुक्रमण के लिए मिलाया जाता है। बाद में, बारकोड दृश्यों(चित्रा 1)19का विश्लेषण करके पूल ्ड अनुक्रमण डेटा को अलग किया जा सकता है। हालांकि, दोनों तरीकों के बीच महत्वपूर्ण मतभेद मौजूद हैं । लिपिड आधारित बारकोडिंग रणनीति लिपिड-संशोधित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स पर आधारित है, जिसमें किसी भी सेल प्रकार की प्राथमिकताएं नहीं पाई गई हैं। जबकि एंटीबॉडी आधारित बारकोडिंग रणनीति केवल एंटीजन प्रोटीन19,20व्यक्त करने वाली कोशिकाओं का पता लगा सकती है । इसके अलावा, लिपिड को दागने में लगभग 10 मिन लगते हैं लेकिन एंटीबॉडी(चित्रा 1)को दागने के लिए 40 मिन। इसके अलावा, लिपिड-संशोधित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स एंटीबॉडी-कॉन्जुगार्ड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की तुलना में सस्ते हैं लेकिन इस लेख को लिखने के समय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। अंत में लिपिड आधारित रणनीति एक प्रयोग में 96 नमूने ले सकती है, लेकिन एंटीबॉडी आधारित रणनीति वर्तमान में केवल मल्टीप्लेक्स 12 नमूने ही ले सकती है।
एक ही प्रयोग में मल्टीप्लेक्स के लिए अनुशंसित सेल संख्या 2.5 x 104से कम होनी चाहिए, अन्यथा, इससे सेल डबल्स और संभावित परिवेश एमआरएनए संदूषण का उच्च प्रतिशत हो जाएगा। मल्टीप्लेक्सिंग रणनीतियों के माध्यम से, एकल सेल कैप्चरिंग, सीडीएनए उत्पादन और कई नमूनों के लिए पुस्तकालय तैयार करने की लागत एक नमूने की लागत तक कम हो जाएगी लेकिन अनुक्रमण लागत समान रहेगी।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हमने एकल सेल ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया है। हमने स्क्आरएनए-सीक्यू वर्कफ्लो में मल्टीप्लेक्स के नमूनों को दो वैकल्पिक तरीके भी उपलब?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ जेवी जे गार्टनर लैब से डेविड एम पैटरसन और क्रिस्टोफर एस मैकगिनिस को लिपिड आधारित बारकोडिंग रिएजेंट्स और प्रायोगिक कदमों और डेटा विश्लेषण पर सुझावों की अपनी तरह की आपूर्ति के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम की स्थापना राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एचएलएल1347202) ने की थी।
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
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