マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析
Summary
ここでは、マウス胚組織における遺伝子発現をプロファイルする多重化単一細胞mRNAシーケンシング法を提示した。多重化戦略と組み合わせた液滴ベースの単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)法は、複数のサンプルから単一細胞を同時にプロファイルできるため、試薬コストを大幅に削減し、実験的なバッチ効果を最小限に抑えることができます。
Abstract
単一細胞mRNAシーケンシングはここ数年で大きな進歩を遂げ、発生生物学の分野で重要なツールとなっています。希少細胞集団の同定、新規マーカー遺伝子の発見、空間的・時間的発達情報の解読に成功しています。単一細胞法は、マイクロ流体ベースのFluidigm C1技術から、過去2~3年で液滴ベースのソリューションへと進化しました。ここでは、液滴ベースのscRNA-Seq法を用いてマウス胚組織細胞をプロファイリングする方法を示す例として心臓を用いた。さらに、1 回の実験で複数のサンプルをプロファイリングするために、2 つの戦略をワークフローに統合しました。統合された方法の1つを使用して、我々は同時に8つの心臓サンプルから9,000以上の細胞をプロファイリングしました。これらの方法は、異なる遺伝的背景、発達段階、または解剖学的位置からの単一細胞を同時にプロファイルする費用対効果の高い方法を提供することにより、発生生物学分野にとって貴重です。
Introduction
各単一細胞の転写プロファイルは、胚発生中の細胞集団によって異なる。situハイブリダイゼーションにおける単一分子は、少数の遺伝子1の発現を可視化するために使用することができるが、単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)は、単一細胞における遺伝子のゲノムワイド発現パターンを例示する偏りのないアプローチを提供する。2009年2月に最初に出版された後、scRNA-Seqは、近年3、4、5の複数の発達段階で複数の組織を研究するために適用されている。また、ヒト細胞アトラスが最近発達に焦点を当てたプロジェクトを立ち上げているため、近い将来、ヒト胚組織からの単一細胞データの生成が期待されています。
最初に発達する臓器としての心臓は胚発生において重要な役割を果たす。心臓は複数の細胞型で構成され、各細胞型の発達は時間的および空間的に厳密に調節される。ここ数年、初期の発達段階における心臓細胞の起源と細胞系統は、先天性心疾患の病因を理解するための非常に有用なナビゲーションツールを提供する6を特徴とし、心筋細胞再生7を刺激するより技術的に高度な方法を開発する。
scRNA-Seqは、近年8、9、10で急速な拡大を遂げています。新たに開発された方法により、単一細胞実験の設計と解析がより達成可能になりました。ここで提示する方法は、液滴溶液に基づく商業手順である(材料表を参照)15、16。この方法は、マイクロ流体コントローラシステムの制御下にある油水エマルジョン液滴中の細胞および一意にバーコードされたビーズのセットを捕捉することを特徴とする。液滴への細胞負荷の速度は極めて低く、液滴エマルションの大部分は1つの細胞17のみを含む。この手順の独創的な設計は、バーコードングと同時に発生する液滴エマルジョンへの単一細胞分離から来ており、異種集団でRNA-Seqを使用して個々の細胞の並列分析を可能にします。
多重化戦略の組み込みは、従来の単一細胞ワークフロー13、14への重要な追加の1つである。この添加は、細胞ダブレットを廃棄し、実験コストを削減し、バッチ効果18、19を排除するのに非常に有用である。脂質ベースのバーコードング戦略と抗体ベースのバーコードング戦略(材料表参照)は、主に多重化法の2つである。特定のバーコードを使用して両方の方法で各サンプルにラベルを付け、ラベル付きサンプルを混合して単一セルのキャプチャ、ライブラリの準備、およびシーケンス処理を行います。その後、バーコードシーケンスを分析することによって、プールされたシーケンスデータを分離することができます (図 1)19.ただし、2 つの方法には大きな違いがあります。脂質ベースのバーコード戦略は、脂質修飾オリゴヌクレオチドに基づいており、細胞型の好みを有することが見つかっていない。抗体ベースのバーコードング戦略は、抗原タンパク質19、20を発現する細胞のみを検出できるが。また、脂質を染色するのに約10分かかりますが、抗体を染色するのに40分かかります(図1)。さらに、脂質修飾オリゴヌクレオチドは抗体共役オリゴヌクレオチドよりも安価であるが、本稿の執筆時点では市販されていない。最後に、脂質ベースの戦略は1回の実験で96サンプルを多重化できますが、抗体ベースの戦略は現在12サンプルしか多重化できません。
単一の実験で多重化する推奨細胞数は2.5 x 104より小さくする必要があり、そうでなければ、細胞ダブレットの高い割合と潜在的な周囲mRNA汚染につながります。多重化戦略により、複数のサンプルの単一セルキャプチャ、cDNA生成、ライブラリ調製のコストは1サンプルのコストに削減されますが、シーケンシングコストは変わりません。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、単一細胞転写プロファイルを解析するプロトコルを実証した。また、scRNA-Seqワークフローでサンプルを多重化する2つのオプションの方法も提供しています。両方の方法は、様々なラボで実現可能であることが証明され、費用対効果が高く、バッチ効果のない単一細胞実験を実行するためのソリューションを提供した。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ゼブ・J・ガートナー博士のデビッド・M・パターソンとクリストファー・S・マクギニス博士のサンプル・J・ガートナー博士に感謝し、脂質ベースのバーコード試薬の供給と実験ステップとデータ分析に関する提案を行いました。この作品は国立衛生研究所(HL13347202)によって設立されました。
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
- Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
- Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
- Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
- Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
- The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
- Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
- Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
- . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
- . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
- . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
- Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
- . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)
