Мультиплексный одноклеточной мРНК Секвенирование Анализ эмбриональных клеток мыши
Summary
Здесь мы представили мультиплексированный метод секвенирования одноклеточного мРНК для профилирования экспрессии генов в эмбриональных тканях мыши. Метод секвенирования одноклеточной мРНК на основе капельных одноклеточных мРНК (scRNA-Seq) в сочетании со стратегиями мультиплексирования может профилировать отдельные ячейки из нескольких образцов одновременно, что значительно снижает затраты на реагенты и сводит к минимуму экспериментальные пакетные эффекты.
Abstract
Одноклеточная мРНК секвенирование добилась значительного прогресса за последние несколько лет и стала важным инструментом в области биологии развития. Он был успешно использован для выявления редких популяций клеток, обнаружить новые гены маркера, и расшифровать пространственную и височную информацию о развитии. Метод одноклеточных также эволюционировал от микрофлюидной основанной технологии Fluidigm C1 к растворам на основе капель в последних 2 до 3 летах. Здесь мы использовали сердце в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как профиль мыши эмбриональных клеток ткани с помощью капли на основе метода scRNA-Seq. Кроме того, мы интегрировали две стратегии в рабочий процесс для профилирование нескольких образцов в одном эксперименте. Используя один из интегрированных методов, мы одновременно профилировали более 9000 клеток из восьми образцов сердца. Эти методы будут полезны для области биологии развития, предоставляя экономически эффективный способ одновременного профиля одиночных клеток из различных генетических слоев, стадий развития, или анатомических местах.
Introduction
Транскрипционный профиль каждой одной клетки варьируется среди клеточных популяций во время эмбрионального развития. Хотя одномолекулярная гибридизация на месте может быть использована для визуализации экспрессии небольшого числа генов1,секвенирование мРНК одной клетки (scRNA-Seq) обеспечивает беспристрастный подход к иллюстрации геномных экспрессионных моделей генов в одиночных клетках. После того, как он был впервые опубликован в 2009 году2, scRNA-Seq был применен для изучения нескольких тканей на нескольких стадиях развития в последние годы3,4,5. Кроме того, в связи с тем, что в последнее время атлас клеток человека приступил к осуществлению своих проектов, ориентированных на развитие, ожидается, что в ближайшем будущем будет получено больше данных о одиночных клетках из эмбриональных тканей человека.
Сердце как первый орган, развиваемый, играет решающую роль в эмбриональном развитии. Сердце состоит из нескольких типов клеток и развитие каждого типа клеток жестко регулируется временно и пространственно. За последние несколько лет, происхождение и клеточная линия сердечных клеток на ранних стадиях развития были охарактеризованы6, которые обеспечивают огромный полезный инструмент навигации для понимания врожденного патогенеза порока сердца, а также для разработки более технологически передовых методов для стимулирования кардиомиоцитов регенерации7.
scRNA-Seq претерпел быстрое расширение в последние годы8,9,10. С недавно разработанными методами, проектирование и анализ экспериментов с одноклеточными стали более достижимыми11,12,13,14. Представленный здесь метод представляет собой коммерческую процедуру, основанную на растворах капель (см. Таблицу Материалов)15,16. Этот метод имеет захват клеток и наборы уникально штрих-кодированных бусин в масляной воде эмульсии капли под контролем микрофлюидной системы контроллера. Скорость загрузки клеток в капли крайне низка, так что большинство эмульсий капель содержат только одну ячейку17. Гениальный дизайн процедуры происходит от разделения одной клетки на эмульсии капель, происходящих одновременно с баркодированием, что позволяет параллельный анализ отдельных клеток с помощью РНК-Сек на неоднородной популяции.
Включение мультиплексирования стратегии является одним из важных дополнений к традиционной одноклеточной рабочего процесса13,14. Это дополнение очень полезно в отбрасывая дублеты клеток, снижение экспериментальных затрат, и устранение пакетных эффектов18,19. Липидная стратегия баркодирования и стратегия баркодирования на основе антител (см. Таблица материалов)являются двумя в основном используемыми методами мультиплексирования. Специфические штрих-коды используются для обозначения каждого образца в обоих методах, а маркированные образцы затем смешиваются для захвата одной ячейки, подготовки библиотеки и секвенирования. После этого объединенные данные секвенирования могут быть разделены путем анализа последовательностей штрих-кодов(рисунок 1)19. Однако между этими двумя методами существуют значительные различия. Стратегия баркодирования на основе липидов основана на липидных модифицированных олигонуклеотидах, которые не имеют каких-либо предпочтений типа клеток. В то время как антитела на основе штрихкодирования стратегия может обнаружить только клетки, выражающие антигенов белков19,20. Кроме того, это занимает около 10 минут, чтобы испачкать липиды, но 40 минут, чтобы испачкать антитела(Рисунок 1). Кроме того, липидно-модифицированные олигонуклеотиды дешевле, чем антитела-конъюгированные олигонуклеотиды, но не коммерчески доступны на момент написания этой статьи. Наконец, на основе липидов стратегия может мультиплекс 96 образцов в одном эксперименте, но антитела на основе стратегии в настоящее время может только мультиплекс 12 образцов.
Рекомендуемый номер ячейки в мультиплекс в одном эксперименте должен быть ниже, чем 2,5 х 104, в противном случае, это приведет к высокому проценту клеточных дублетов и потенциального загрязнения окружающей среды мРНК. Благодаря стратегиям мультиплексирования стоимость захвата одной ячейки, генерации кДНК и подготовки библиотеки для нескольких образцов будет снижена до стоимости одного образца, но стоимость секвенирования останется прежней.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы продемонстрировали протокол для анализа одноклеточных транскрипционных профилей. Мы также предоставили два дополнительных метода для мультиплексных образцов в рабочем процессе scRNA-Seq. Оба метода оказались осуществимыми в различных лабораториях и предоставили …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Дэвида М. Паттерсона и Кристофера С. Макгинниса из лаборатории доктора Зев Дж. Гартнера за их добрые поставки липидных баркодирующих реагентов и предложения по экспериментальным шагам и анализу данных. Эта работа была основана Национальными институтами здравоохранения (HL13347202).
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
- Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
- Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
- Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
- Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
- Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
- The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
- Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
- Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
- McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
- Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
- . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
- . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
- . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
- . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
- Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
- Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
- . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)
