Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells
Summary
Aquí presentamos un método de secuenciación de ARNm de una sola célula multiplexado para perfilar la expresión génica en tejidos embrionarios de ratón. El método de secuenciación de mRNA de una sola célula basada en gotas (scRNA-Seq) en combinación con estrategias de multiplexación puede perfilar celdas individuales de varias muestras simultáneamente, lo que reduce significativamente los costos de reactivos y minimiza los efectos experimentales por lotes.
Abstract
La secuenciación de ARNm de una sola célula ha hecho progresos significativos en los últimos años y se ha convertido en una herramienta importante en el campo de la biología del desarrollo. Se ha utilizado con éxito para identificar poblaciones de células raras, descubrir nuevos genes marcadores y decodificar información espacial y temporal del desarrollo. El método de una sola célula también ha evolucionado de la tecnología Fluidigm C1 basada en microfluidos a las soluciones basadas en gotas en los últimos dos o tres años. Aquí usamos el corazón como ejemplo para demostrar cómo perfilar las células del tejido embrionario del ratón usando el método scRNA-Seq basado en gotas. Además, hemos integrado dos estrategias en el flujo de trabajo para generar perfiles de varias muestras en un solo experimento. Utilizando uno de los métodos integrados, hemos perfilado simultáneamente más de 9.000 células de ocho muestras de corazón. Estos métodos serán valiosos para el campo de la biología del desarrollo al proporcionar una manera rentable de perfilar simultáneamente células individuales de diferentes orígenes genéticos, etapas de desarrollo o ubicaciones anatómicas.
Introduction
El perfil transcripcional de cada célula individual varía entre las poblaciones celulares durante el desarrollo embrionario. Aunque la hibridación molecular in situ única se puede utilizar para visualizar la expresión de un pequeño número de genes1, la secuenciación de ARNm de una sola célula (scRNA-Seq) proporciona un enfoque imparcial para ilustrar los patrones de expresión de genes en todo el genoma en células individuales. Después de su publicación por primera vez en 20092, scRNA-Seq se ha aplicado para estudiar múltiples tejidos en múltiples etapas de desarrollo en los últimos años3,4,5. Además, a medida que el atlas de células humanas ha lanzado recientemente sus proyectos centrados en el desarrollo, se espera que en un futuro próximo se generen más datos de células únicas de tejidos embrionarios humanos.
El corazón como el primer órgano en desarrollarse desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario. El corazón consta de varios tipos de células y el desarrollo de cada tipo de célula está estrechamente regulado temporal y espacialmente. En los últimos años, el origen y el linaje celular de las células cardíacas en las primeras etapas del desarrollo se han caracterizado6,que proporcionan una tremenda herramienta de navegación útil para la comprensión de la patogénesis congénita de enfermedades cardíacas, así como para el desarrollo de métodos más tecnológicamente avanzados para estimular la regeneración de cardiomiocitos7.
El scRNA-Seq ha experimentado una rápida expansión en los últimos años8,9,10. Con los métodos recién desarrollados, el diseño y análisis de experimentos de una sola célula se ha vuelto más alcanzable11,12,13,14. El método presentado aquí es un procedimiento comercial basado en las soluciones de gotas (ver Tabla de Materiales)15,16. Este método cuenta con la captura de células y conjuntos de cuentas con código de barras única en una gota de emulsión aceite-agua bajo el control de un sistema de controlador microfluídico. La velocidad de carga de celdas en las gotas es extremadamente baja, por lo que la mayoría de las emulsiones de gotas contienen solo una celda17. El ingenioso diseño del procedimiento proviene de la separación de una sola célula en emulsiones de gotas que ocurren simultáneamente con la codificación de barras, lo que permite el análisis paralelo de células individuales utilizando ARN-Seq en una población heterogénea.
La incorporación de estrategias de multiplexación es una de las adiciones importantes al flujo de trabajo de una sola célula tradicional13,14. Esta adición es muy útil para desechar los dobletes celulares, reducir los costos experimentales y eliminar los efectos por lotes18,19. Una estrategia de codificación de barras basada en lípidos y una estrategia de codificación de barras basada en anticuerpos (ver Tabla de Materiales)son los dos métodos de multiplexación utilizados principalmente. Los códigos de barras específicos se utilizan para etiquetar cada muestra en ambos métodos, y las muestras etiquetadas se mezclan para la captura de una sola celda, la preparación de la biblioteca y la secuenciación. Después, los datos de secuenciación agrupados se pueden separar analizando las secuencias de códigos de barras (Figura 1)19. Sin embargo, existen diferencias significativas entre los dos métodos. La estrategia de codificación de barras basada en lípidos se basa en oligonucleótidos modificados con lípidos, que no se ha encontrado que tenga ninguna preferencia de tipo de célula. Mientras que la estrategia de codificación de barras basada en anticuerpos sólo puede detectar las células que expresan las proteínas antígeno19,20. Además, se tarda unos 10 minutos en manchar los lípidos, pero 40 minutos para manchar los anticuerpos(Figura 1). Además, los oligonucleótidos modificados con lípidos son más baratos que los oligonucleótidos conjugados con anticuerpos, pero no están disponibles comercialmente en el momento de escribir este artículo. Por último, la estrategia basada en lípidos puede multiplexar 96 muestras en un solo experimento, pero la estrategia basada en anticuerpos actualmente solo puede multiplexar 12 muestras.
El número de celda recomendado para multiplexar en un solo experimento debe ser inferior a 2,5 x 104, de lo contrario, conducirá a un alto porcentaje de dobletes celulares y una posible contaminación del ARNm ambiental. A través de las estrategias de multiplexación, el costo de captura de una sola célula, generación de ADNc y preparación de bibliotecas para múltiples muestras se reducirá al costo de una muestra, pero el costo de secuenciación seguirá siendo el mismo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, hemos demostrado un protocolo para analizar perfiles transcripcionales de una sola célula. También hemos proporcionado dos métodos opcionales para multiplexar muestras en el flujo de trabajo scRNA-Seq. Ambos métodos han demostrado ser factibles en varios laboratorios y han proporcionado soluciones para ejecutar un experimento de una sola célula rentable y libre de efectos por lotes18,26.
Hay algunos pasos que debe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a David M. Patterson y Christopher S. McGinnis del laboratorio Dr. Zev J. Gartner por su amable suministro de los reactivos de codificación de barras basados en lípidos y sugerencias sobre los pasos experimentales y el análisis de datos. Este trabajo fue fundado por los Institutos Nacionales de Salud (HL13347202).
Materials
| 10% Tween-20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Chip Holder | 10x Genomics | 120252 330019 | |
| 10x Chromium Controller | 10x Genomics | 120223 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x Genomics | 120250 230003 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x Genomics | 330002, 120251 | |
| 10x Vortex Clip | 10x Genomics | 120253 230002 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991AA | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| Barcode Oligo | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 25 nmol |
| Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| CD1 mice | Chales River | Strain Code 022 | ordered pregnant mice |
| Centrifuge 5424R | Appendorf | 2231000214 | |
| Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns | 10x Genomics | 1000073 | Store at ambient temperature |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10x Genomics | 120262 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns | 10x Genomics | 1000094 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' Library Kit v3 | 10x Genomics | 1000095 | Store at -20 °C |
| Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads | 10x Genomics | 2000059 | Store at -80 °C |
| Collagenase A | Sigma/Millipore | 10103578001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| Collagenase B | Sigma/Millipore | 11088807001 | Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL | Eppendorf | 022431021 | |
| DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL | Eppendorf | 022431048 | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x Genomics | 2000048 | Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1) |
| DynaMag-2 Magnet | Theromo Scientific | 12321D | |
| Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) | Sigma | E7023-500mL | |
| Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-70C | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning Cellgro | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Fisher Scientific | 26140079 | Store at -20 °C |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl | Theromo Scientific | 4661020N | |
| Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl | Theromo Scientific | 4661000N | |
| Flowmi Cell Strainer | Sigma | BAH136800040 | Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-32 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14170112 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | BioLegend | 422301 | Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume |
| Isopropanol (IPA) | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Fisher Scientific | NC0295239 | Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer) | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090-015 | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950W | |
| Nuclease-Free Water (Ambion) | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 951010022 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product) | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
| Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes | Fisher Scientific | 05-403-151 | |
| Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit) | Beckman Coulter | B23318 (60ml) | |
| Template Switch Oligo | 10x Genomics | 3000228 | Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1) |
| The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing | |||
| The cell browser is Loup Cell Browser | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser | |
| The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger | 10x Genomics | https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger | |
| The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq | |||
| The well maintained R platform is Seurat V3 | satijalab | https://satijalab.org/seurat/ | |
| TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-3710 | |
| TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1182-1730 | |
| TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip | USA Scientific | 1180-8710 | |
| TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody | BioLegend | 155801 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody | BioLegend | 155803 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody | BioLegend | 155805 | 0.1 – 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells |
| TrueSeq RPI primer | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1) |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher Scientific | 25200-056 | |
| Universal I5 | Integrated DNA Technologies | Single-stranded DNA | 100 nmol |
References
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