비보 모델에서 닭 융모난토암 막을 사용하여 부인과 및 비뇨기과 암을 연구
Summary
우리는 부인과 및 비뇨기과 암 세포주 및 환자 유래 종양의 이식에 대한 대안, 이식 가능한 생체 내 모델로 닭 융모알구암 막 모델을 제시합니다.
Abstract
마우스 모델은 생체 내 암 연구에 대한 벤치 마크 테스트입니다. 그러나, 비용, 시간 및 윤리적고려는 생체내 암 모형에 있는 대안을 요구하기 위하여 지도했습니다. 닭 융모난토암 막 (CAM) 모형은 종양 발달의 직접적인 가시화를 허용하고 생체 내 화상 진찰을 위해 적당한 저렴하고, 급속한 대안을 제공합니다. 이와 같이, 우리는 부인과 및 비뇨기과 종양을 이 모형으로 접착하기 위한 최적화된 프로토콜을 개발하기 위하여 노력했습니다, 우리는 여기에서 제출합니다. 약 7 일 후, 공기 세포는 껍질에 개구부가 생성되는 계란의 혈관 측으로 이동됩니다. 뮤린과 인간 세포주 및 1 차적인 조직에서 종양은 그 때 이식될 수 있습니다. 이들은 일반적으로 세포 분산을 피하고 세포가 혈관 공급을 모집 할 때까지 영양 지원을 제공하기 위해 세포 외 매트릭스와 매체의 혼합물에서 시드됩니다. 종양은 그 때 계란 부화하기 전에 추가 14 일까지 증가할 수 있습니다. 반딧불이 루시퍼라제로 안정적으로 변형된 세포를 이식함으로써, 생물 발광 이미징은 배아 전체에 퍼진 막 및 암세포에서 종양 성장의 민감한 검출에 사용될 수 있다. 이 모델은 잠재적으로 종양성, 침략, 전이 및 치료 효과를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 치킨 CAM 모델은 기존 뮤린 모델에 비해 훨씬 적은 시간과 재정적 자원을 필요로합니다. 계란은 면역 손상 및 면역 내성 때문에, 어떤 유기체에서 조직은 잠재적으로 인간 조직의 이식에 필요한 비용이 많이 드는 형질 전환 동물없이 이식 될 수있다 (예를 들어, 마우스). 그러나, 이 모형의 많은 이점은 잠재적으로 또한 짧은 종양 생성 시간 및 면역 타협/면역 관용 상태를 포함하여 제한일 수 있었습니다. 추가적으로, 닭 chorioallantoic 막 모형에 여기에서 제출된 모든 종양 모형이 있더라도, 종양 성장의 다양한 각도로 이렇게 합니다.
Introduction
마우스는 악성종양을 포함한 인간 질병의 연구를 위한 고전적인 모델 유기체로서 사용되어 왔습니다. 포유류로서, 그들은 인간과 많은 유사점을 공유합니다. 그들의 높은 수준의 유전 적 유사성은 인간 질병의 유전 적 통제에 대한 엄청난 통찰력을 제공하기 위해 마우스 게놈의 형질 전환 조작을허용했습니다 1. 마우스를 취급하고 실험에 있는 광대한 경험은 생물 의학 연구를 위한 선택의 모형 귀착되었습니다. 그러나, 뮤린 모델에 관한 윤리적, 과학적 우려 뿐만 아니라, 그들은 또한 매우 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요 될 수 있습니다2,3. 종양의 발달은 몇 주 또는 몇 달이 걸릴 수 있습니다. 종양이 발전하는 동안 일반적인 기관의 주택만으로도 수백에서 수천 달러의 주택이 운영될 수 있습니다. 난소암은 뮤린 모델에서의 성장이 수개월이 걸릴 수 있기 때문에 이러한 단점의 예입니다. 연구 진행에 있는 지연은 잠재적으로 난소암 환자에 영향을 미칠 수 있습니다’ 지속적으로 낮은 5 년 생존율만 47%(즉,30 년 동안 단지 10%의 생존율증가)4. 유사하게, 비뇨기과 암 (신장, 전립선 및 방광암)는 미국에 있는 모든 암 케이스의 19%를 구성하고 암 관련죽음의11%를 4. 따라서, 부인과 및 비뇨기과 암을 연구하는 생체 내 새로운 접근법은 이 모형이 초기 선별 실험에만 적용되더라도 실험실상당한 시간, 노동 및 돈을 절약할 수 있었습니다. 추가적으로, 연구 사실 인정의 결과적인 가속은 이 암으로 매년 진단된 177,000명의 개별에 현저하게 영향을 미칠 수 있었습니다.
치킨 CAM 모델은 앞서 언급 한 문제를 해결하는 많은 장점을 제공합니다. 혈관 신생을 연구하는 인기있는 모델5,6,종양 세포 침공7,8,및 전이7,9,병아리 배아 CAM 모델은 이미 신경교종10,11,12,두경부 편평 세포 암13,14,백혈병15,16,췌장 암17,췌장 암 등 다양한 형태의 암을 연구하는 데 사용되었습니다. 대장암18. 또한, CAM 모델은 신경아세포종19,버킷림프종20,흑색종21,및 펠린 섬유육종22에대해 생성되었다. 선행 연구는 또한 방광암(23)과 전립선암 세포주24의생착을 제시했습니다, 그러나 한정된 프로토콜 세부사항. 뿐만 아니라 계란은 쥐 보다 훨씬 저렴, 하지만 그들은 또한 매우 재현 가능한 결과 생산25,26. 그(것)들은 빠른 혈관 발달을 보여주고, 종양 생착은 며칠로 빨리 생기고 열린 창을 통해서 세로로 구상될 수 있습니다. 난자 수정과 부화 사이의 21 일 기간으로 몇 주 이내에 실험을 완료 할 수 있습니다. 또한, 저렴한 비용, 제한된 주택 요구, 작은 크기는 마우스 연구에 대한 금지 될 대규모 실험을 쉽게 허용.
따라서, 우리는 부인과 및 비뇨기과 암의 생착에 대한 CAM 모델을 최적화하기 위해 노력했다. 초기 닭배아(27)의면역 손상 상태로 인해, 마우스 및 인간 세포 모두 쉽게 이식될 수 있다. 이와 같이, 우리는 성공적으로 난소, 신장, 전립선 및 방광암을 이식했습니다. 이러한 종양 유형의 각각에 대 한, CAM 쉽게 설립 된 뮤린 및 인간 종양 세포 주를 받아들입니다. 중요 한 것은, 갓 수확 기본 인간의 종양 조직 또한 성공의 높은 속도 소화 된 세포 또는 고체 조직의 조각에서 생착 수 있습니다. 이 암 모형 및 세포 근원의 각각은 우리가 여기에서 공유하는 최적화를 요구합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CAM 모델을 사용하여 종양 확장 및 생착은 생체 내 동물 모델에서 기존 모델보다 더 빠르고 직접적으로 관찰 가능한 종양 성장을 허용합니다. 또한, 특히 면역 손상 마우스의 비용과 비교할 때 장비의 초기 구매가 완료되면 비용이 현저히 낮습니다. 닭 배아의 초기, 면역 손상 상태는 쉽게 인간과 뮤린 조직의 생착을 허용합니다. 이러한 강점에도 불구하고 CAM 모델에는 한계가 있습니다. 장기적인 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 이 방법에 대한 초기 교육에 대해 다마노이 후유히코 박사와 빈 부 박사에게 감사를 표하고자 합니다. Eva Koziolek 박사와의 논의는 이러한 접근 방식을 최적화하는 데 중요한 역할을 했으며 매우 감사하게 평가되었습니다. 이 작품은 다음과 같은 출처에서 자금조달없이 가능하지 않았을 것이다: 담배 관련 질병 연구 프로그램 박사 후 펠로우십 (27FT-0023, 국방부(DoD) 난소암 연구 프로그램(W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH(1R21CA216770), 담배 관련 질병 연구 프로그램 고영향 파일럿 어워드(27IR-0016), UCLA 기관 지원, JCCC 종자 그랜트 (NCI / NIH P30CA016042) 및 LW에 대한 연구를위한 부총장의 사무실에서 3R 그랜트를 포함.
Materials
| -010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
| C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
| CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
| Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
| Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
| Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red – Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
| HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
| ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
| Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
| Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
| Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
| MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
| Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
| RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
| Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
| Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
| Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
| T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
| Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
| Tygon Clear Laboratory Tubing – 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |
References
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