Identifizieren von Inhibitoren der HBx-DDB1-Wechselwirkung mit einem Split Luciferase Assay System
Summary
Hier stellen wir eine Methode zum Screening von Anti-Hepatitis-B-Virusmitteln vor, die die HBx-DDB1-Wechselwirkung mit einem Split-Luziferase-Assay-System hemmen. Dieses System ermöglicht den einfachen Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen und eignet sich zur Identifizierung von Inhibitoren solcher Wechselwirkungen.
Abstract
Es besteht ein dringender Bedarf an neuartigen therapeutischen Wirkstoffen für die Infektion mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV). Obwohl derzeit verfügbare Nukleos(t)ide Analoge die Virusreplikation stark hemmen, haben sie keine direkte Wirkung auf die Expression viraler Proteine, die aus einer viralen kovalent geschlossenen kreisförmigen DNA (cccDNA) transkribiert wurden. Da eine hohe virusfreie Antigenbelastung bei dieser chronischen und HBV-bedingten Karzinogenese eine Rolle spielen kann, ist das Ziel der HBV-Behandlung die Ausrottung viraler Proteine. Das HBV-Regulierungsprotein X (HBx) bindet an das an den Wirt dna schädigende Protein 1 (DDB1) Protein, um die strukturelle Erhaltung der Chromosomen 5/6 (Smc5/6) zu abbauen, was zu einer Aktivierung der viralen Transkription aus cccDNA führt. Hier präsentieren wir mit Einem Split Luciferase Complementation Assay System ein umfassendes zusammengesetztes Screening-System zur Identifizierung von Inhibitoren der HBx-DDB1-Wechselwirkung. Unser Protokoll ermöglicht eine einfache Erkennung der Interaktionsdynamik in Echtzeit in lebenden Zellen. Diese Technik kann ein wichtiger Test werden, um neue therapeutische Wirkstoffe für die Behandlung von HBV-Infektion zu entdecken.
Introduction
Die Hepatitis-B-Infektion (HBV) ist weltweit ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit: Jährliche Schätzungen von 240 Millionen chronisch mit HBV infizierten Menschen und 90.000 Todesfällen aufgrund von Komplikationen durch die Infektion, einschließlich Zirrhose und Hepatozellulärem Karzinom (HCC)1. Obwohl die derzeitigen Anti-HBV-Therapeutika, Nukleos(t)ide-Analoga, die virale Reverse-Transkription ausreichend hemmen, erreichen sie selten die Eliminierung viraler Proteine, was das langfristige klinische Ziel ist. Ihre schlechte Wirkung auf die virale Proteinelimination ist auf ihre fehlende direkte Wirkung auf die virale Transkription von episomalen viralen kovalent geschlossenen kreisförmigen DNA-Minichromosomen (cccDNA) im Hepatozytenkern2zurückzuführen.
Die HBV-Transkription wird durch das HBV-regulatorische X (HBx)-Protein3aktiviert. Jüngste Studien zeigten, dass HBx die strukturelle Erhaltung der Chromosomen 5/6 (Smc5/6), ein Host-Restriktionsfaktor, der die HBV-Transkription von cccDNA blockiert, durch Entführung eines DDB1-CUL4-ROC1 E3 Ubiquitin Ligase-Komplexes4,5,6abbaut. Daher wird angenommen, dass ein entscheidender Schritt bei der Förderung der viralen Transkription von cccDNA die HBx-DDB1-Interaktion ist. Verbindungen, die die Bindung zwischen HBx und DDB1 hemmen können, können die virale Transkription blockieren, und in der Tat wurde Nitazoxanid als Inhibitor der HBx-DDB1-Wechselwirkung über ein in unseremLaborentwickeltes Screening-System 7 identifiziert.
Hier stellen wir Ihnen unser praktisches Screening-System vor, mit dem Inhibitoren der HBx-DDB1-Wechselwirkung identifiziert werden, die einen split luciferase komplementären Assay7,8verwendet. Split-Luziferase-Untereinheiten werden mit HBx und DDB1 verschmolzen, und die HBx-DDB1-Interaktion bringt die Untereinheiten in die Nähe, um ein funktionelles Enzym zu bilden, das ein helles Leuchtsignal erzeugt. Da die Wechselwirkung zwischen den Untereinheiten reversibel ist, kann dieses System schnell dissoziierende HBx-DDB1-Proteine erkennen (Abbildung 1). Mit diesem System kann eine große zusammengesetzte Bibliothek leicht überprüft werden, was zur Entdeckung neuartiger Verbindungen führen kann, die die HBx-DDB1-Interaktion effizient hemmen können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir entwickelten ein praktisches Screening-Verfahren mit einem Split-Luziferase-Assay, um HBx-DDB1-Bindungshemmer zu finden. Die Interaktionsdynamik kann in Echtzeit in lebenden Zellen ohne Zelllyse nachgewiesen werden. Die Hemmung der HBx-DDB1-Wechselwirkung führt zur Wiederherstellung von Smc5/6, was zur Unterdrückung der viralen Transkription, Proteinexpression und cccDNA-Produktion7führt. Dieser neuartige Mechanismus der antiviralen Wirkung kann die Unzulänglichkeiten der aktuellen HBV-The…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des Bildungsministeriums, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie, Japan (#19H03430 und #17K09405 m.O., und #19J11829 an K.S.), durch ein Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (#18H05024 to M.O.), by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development, AMED (to M.O., #JP19fk021005), by program on the Innovative Development and the Application of New Drugs for Hepatitis B (#JP19fk0310102 to K.K.) die Japan Foundation for Applied Enzymology und von der Kobayashi Foundation for Cancer Research (to M.O.), von GSK Japan Research Grant 2018 (an K.S.) und durch ein Stipendium der Miyakawa Memorial Research Foundation (an K.S.).
Materials
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
References
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