Système efficace d’expression plasmide contrôlée par transcription pour l’étude de la stabilité des transcriptions de l’ARNm dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires
Summary
Ici, nous présentons un outil qui peut être employé pour étudier la modulation posttranscriptionale d’une transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires en utilisant un système inductible d’expression couplé à une technique d’électroporation de pipette.
Abstract
L’étude de la réglementation posttranscriptionnelle est fondamentale pour comprendre la modulation d’un ARN messager donné (ARNM) et son impact sur l’homéostasie cellulaire et le métabolisme. En effet, les fluctuations de l’expression de transcription pourraient modifier l’efficacité de la traduction et, en fin de compte, l’activité cellulaire d’une transcription. Plusieurs approches expérimentales ont été développées pour étudier la demi-vie de l’ARNm bien que certaines de ces méthodes aient des limites qui empêchent l’étude appropriée de la modulation posttranscriptionale. Un système d’induction promoteur peut exprimer un gène d’intérêt sous le contrôle d’un promoteur synthétique tétracycline.regulated. Cette méthode permet l’estimation de demi-vie d’un ARNm donné dans n’importe quelle condition expérimentale sans troubler l’homéostasie cellulaire. Un inconvénient majeur de cette méthode est la nécessité de transfecter les cellules, ce qui limite l’utilisation de cette technique dans les cellules primaires isolées qui sont très résistantes aux techniques de transfection conventionnelles. Les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire ont été largement utilisées pour étudier la biologie cellulaire et moléculaire de l’épithélium alvéolaire. Les caractéristiques uniques et le phénotype des cellules alvéolaires primaires font qu’il est essentiel d’étudier les modulations posttranscriptionnelles des gènes d’intérêt dans ces cellules. Par conséquent, notre objectif était de développer un nouvel outil pour étudier les modulations posttranscriptionnelles des ARNm d’intérêt pour les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire. Nous avons conçu un protocole transitoire rapide et efficace de transfection pour insérer un système d’expression plasmide contrôlé par transcription dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires. Cette stratégie de clonage, utilisant une épitope virale pour marquer la construction, permet la discrimination facile de l’expression de construction de celle des ARNm endogènes. À l’aide d’une méthode modifiée du cycle de quantification (Cq), l’expression de la transcription peut ensuite être quantifiée à différents intervalles de temps pour mesurer sa demi-vie. Nos données démontrent l’efficacité de cette nouvelle approche en étudiant la régulation posttranscriptionnelle dans diverses conditions pathophysiologiques dans les cellules épithéliales alvéolaires primaires.
Introduction
Plusieurs techniques ont été développées pour déterminer la demi-vie des ARNm. La technique de désintégration de la chasse au pouls, qui utilise des ARNm étiquetés, permet l’évaluation simultanée d’un grand bassin d’ARNm avec une perturbation cellulaire minimale. Cependant, cette approche ne permet pas une estimation directe de la demi-vie d’une transcription génétique unique et ne peut pas être mise en œuvre pour étudier la modulation posttranscriptionnelle d’un ARNm suivant la stimulation avec des facteurs de croissance, ROS, alarmines, ou inflammation1.
L’utilisation d’inhibiteurs de transcription, tels que l’actinomycine D et l’amanitine, est une méthode relativement simple pour mesurer la cinétique de dégradation de l’ARNm au fil du temps. L’un des principaux avantages de cette approche par rapport à celui des techniques précédentes (c.-à-d. la chasse au pouls) repose sur la capacité d’estimer directement la demi-vie d’une transcription donnée et de comparer comment différents traitements pourraient affecter sa cinétique de dégradation. Cependant, l’impact délétère significatif des inhibiteurs de transcription sur la physiologie cellulaire représente un inconvénient majeur de l’approche2. En effet, l’inhibition de l’ensemble du transcriptome cellulaire avec ces médicaments a l’effet secondaire négatif de perturbing la synthèse des éléments clés impliqués dans la stabilité de l’ARNm, tels que les microARN (miRNAs), ainsi que l’expression et la synthèse des protéines liant l’ARN, qui sont importants pour la dégradation et la stabilité de l’ARNm. La perturbation sévère de la transcription de gène par ces drogues pourrait donc modifier artefactually les courbes de dégradation des transcriptions.
Le système d’induction du promoteur représente une troisième approche pour mesurer la demi-vie d’un ARNm spécifique. Cette méthode mesure la dégradation d’un ARNm spécifique de la même manière que les méthodes qui utilisent des inhibiteurs de transcription. Deux types de systèmes d’induction sont fréquemment utilisés : le promoteur c-fos induit par le sérum3 et le système inductible Tet-Off4. Avec le système c-fos, l’utilisation d’inhibiteurs de transcription qui peuvent être toxiques pour la cellule n’est pas nécessaire. Cependant, cette méthode nécessite la synchronisation du cycle cellulaire, ce qui empêche l’évaluation de la stabilité réelle d’une transcription pendant l’interphase5. En revanche, le système Tet-Off permet l’expression forte du gène d’intérêt (GOI) sous le contrôle d’un promoteur synthétique tétracycline réglementé. Ce système nécessite la présence de deux éléments qui doivent être cotransfectés dans la cellule pour être fonctionnel. Le premier plasmide (pTet-Off) exprime la protéine réglementaire tTA-Adv, un facteur hybride de transcription synthétique composé du répresseur procaryotique TetR (d’Escherichia coli) fusionné à trois domaines de transactivation de transcription de la protéine virale HSV VP16. Le GOI est cloné dans le plasmide pTRE-Tight sous le contrôle d’un promoteur synthétique (PTight), comprenant la séquence minimale du promoteur de cytomégalovirus (CMV) fusionné à sept répétitions de la séquence de l’opérateur tetO. La transcription du gène en aval de PTight dépend de l’interaction de TetR avec le tetO. En présence de tétracycline ou de son dérivé, doxycycline, le répresseur TetR perd son affinité pour l’opérateur tetO, conduisant à une cessation de la transcription4. Les caractéristiques du système Tet-Off en font un modèle idéal pour l’étude de l’expression spécifique de l’ARNm dans les cellules eucaryotes tout en évitant les effets pléiotropic potentiels qui sont secondaires à l’absence de séquences réglementaires procaryotes dans la cellule eucaryote6. Habituellement, les lignes cellulaires Tet-Off doublement stables (HEK 293, HeLa et PC12) sont utilisées avec ce système pour intégrer des copies des plasmides de régulateur et de réponse pour un accès pratique à l’expression génique contrôlable7,8,9.
Plusieurs modèles de cellules épithéliales alvéolaires en culture ont été utilisés pour étudier la biologie cellulaire et moléculaire de l’épithélium alvéolaire. Pendant des années, les chercheurs ont largement utilisé les cellules primaires humaines ou rongrices10,11 ainsi que des lignées cellulaires immortalisées telles que les cellules humaines A549 ou rat RLE-6TN12,13. Bien qu’elles soient généralement moins prolifératives et plus difficiles à culture et à transfecter, les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire demeurent l’étalon-or pour l’étude de la fonction et du dysfonctionnement de l’épithélium alvéolaire dans des conditions physiologiques et pathologiques. En effet, les lignées cellulaires immortalisées telles que les cellules A549 ne présentent pas les caractéristiques complexes et les phénotypes des cellules primaires, tandis que les cellules épithéliales alvéolaires de la culture primaire récapitulent les principales propriétés de l’épithélium alvéolaire, en particulier la capacité de former une barrière polarisée et serrée14,15. Malheureusement, ces cellules sont très résistantes aux techniques de transfection conventionnelles, telles que celles utilisant des liposomes, ce qui rend très difficile l’utilisation d’un système induit par un promoteur comme le Tet-Off.
La modulation posttranscriptionnelle des ARNm est l’une des méthodes les plus efficaces pour moduler rapidement l’expression génique d’une transcription16. La région non traduite de l’ARNM 3 (3′ UTR) joue un rôle important dans ce mécanisme. Il a été démontré que, contrairement à l’UTR de 5′, il existe une corrélation exponentielle entre la longueur de l’UTR de 3′ et les complexités cellulaires et morphologiques d’un organisme. Cette corrélation suggère que l’UTR 3′, comme les régions de codage de l’ARNm, a été soumis à la sélection naturelle pour permettre une modulation posttranscriptionnelle de plus en plus complexe tout au long de l’évolution17. L’UTR 3′ contient plusieurs sites de liaison pour les protéines et les miARN qui affectent la stabilité et la traduction de la transcription.
Dans le présent travail, nous avons développé un outil pour étudier le rôle des domaines hautement conservés dans les 3′ UTR d’un GOI pour le contrôle de la stabilité des transcriptions. Nous nous sommes concentrés sur le canal épithélial de sodium, sous-unité alpha (ENaC), qui joue un rôle clé dans la physiologie épithéliale alvéolaire18. Les cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire ont été avec succès transitoirement transagères avec les deux composants du système Tet-Off, qui permet l’étude du rôle de l’UTR 3′ dans la stabilité de l’ARNm avec un système qui affecte de façon minimale la physiologie cellulaire et le métabolisme par rapport à l’utilisation des inhibiteurs de transcription avec d’autres protocoles. Une stratégie de clonage a été développée pour différencier l’expression du GOI de celle du gène endogène à l’aide d’une épitope non endogènement exprimée (V5). La réponse et les plasmides régulateurs ont ensuite été transférés dans les cellules épithéliales alvéolaires utilisant une technique d’électroporation de pipette. Par la suite, l’expression de la transcription a été mesurée en incuber les cellules avec la doxycycline à différents intervalles de temps. La demi-vie de la transcription a été évaluée par RT-qPCR avec une méthode modifiée de Cq utilisant le produit transfected de tTA-Ad mRNA pour la normalisation. Grâce à notre protocole, nous offrons un moyen pratique d’étudier plus en détail la modulation posttranscriptionnelle d’une transcription dans différentes conditions et de définir plus en détail l’implication des régions non traduites.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le faible taux de transfection des cellules épithéliales alvéolaires dans la culture primaire a été une limitation sérieuse pour l’utilisation du système Tet-Off pour évaluer la stabilité de l’ARNm dans ces cellules. Cependant, cette limitation a été surmontée par l’électroporation de pipette, permettant une efficacité de transfection de 25-30%(figure 1 et figure 3)26.
La mesure de la stabil…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Francis Migneault a reçu une bourse du Réseau de santé respiratoire du Québec et du programme de formation pulmonaire des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), d’un programme d’études de la FRSQ et d’un poste d’étudiant de la Faculté des Études Supérieures et Postdoctorales, Université de Montréal. Ces travaux ont été appuyés par la Chaire Gosselin-Lamarre en recherche clinique et les Instituts de recherche en santé du Canada [YBMOP-79544].
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
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