Analisi della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide
Summary
Viene presentato un metodo conveniente, veloce ed economico per misurare la proporzione di cellule della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide.
Abstract
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono una causa importante di crescita tumorale, metastasi e recidiva. L’isolamento e l’identificazione dei CSC sono di grande importanza per la ricerca sul tumore. Attualmente, diverse tecniche sono utilizzate per l’identificazione e la purificazione dei CSC dai tessuti tumorali e dalle linee cellulari tumorali. La separazione e l’analisi delle cellule della popolazione laterale (SP) sono due dei metodi comunemente usati. I metodi si basano sulla capacità dei CSC di espellere rapidamente coloranti fluorescenti, come hoechst 33342. L’efflux del colorante è associato ai trasportatori di cassette di legame ATP (ABC) e può essere inibito dagli inibitori del trasportatore ABC. Vengono descritti i metodi per la colorazione delle cellule tumorali coltivate con Hoechst 33342 e l’analisi della proporzione delle loro cellule SP mediante citometria a flusso. Questo test è conveniente, veloce ed economico. I dati generati in questo saggio possono contribuire a una migliore comprensione dell’effetto dei geni o di altri segnali extracellulari e intracellulari sulle proprietà di staminali delle cellule tumorali.
Introduction
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono sottoinsiemi di cellule con capacità di autorinnoto e potenziale di differenziazione multipla, che svolgono un ruolo vitale nella crescita tumorale, metastasi erecidiva 1,2. Attualmente, i CSC sono stati identificati per esistere in una varietà di tumori maligni, tra cui tumori polmonari, cerebrali, pancreas, prostata, seno e fegato3,4,5,6,7,8,9. L’identificazione dei CSC in questi tumori si basa principalmente sulla presenza di proteine marcatori superficiali, come l’alta e/o bassa espressione di CD44, CD24, CD133 e Sca-19,10, ma un marcatore unico in grado di distinguere le CSC dai non CSC non è stato segnalato finora. Attualmente, diverse tecniche sono utilizzate per identificare e purificare i CSC nei tessuti tumorali o nelle linee cellulari tumorali. Queste tecniche sono progettate in base alle proprietà specifiche dei CSC. Tra questi, i saggi e lo smistamento delle cellule della popolazione laterale (SP) sono due dei metodi comunemente usati.
Le cellule SP sono state originariamente scoperte da Goodell etal. Quando le cellule del midollo osseo del topo furono etichettate con il colorante fluorescente Hoechst 33342, un piccolo gruppo di cellule macchiate di hoechst 33342 appariva nel grafico a punti bidimensionale di un saggio di citometria a flusso. Hoechst 33342 è un colorante legante il DNA e ha almeno due modalità di legame che portano a diverse caratteristiche spettrali. Quando si visualizza l’emissione di fluorescenza a due lunghezze d’onda contemporaneamente, è possibile rivelare più popolazioni12. Nel loro saggio, l’Hoechst 33342 era eccitato a 350 nm e la fluorescenza è stata misurata utilizzando il filtro passa-banda (BP) da 450/20 nm e il filtro perimetrale long-pass (EFLP)11da 675 nm. Rispetto all’intera popolazione di cellule del midollo osseo, questo gruppo di cellule è stato arricchito con cellule staminali ematopoietiche chiamate cellule SP11. Le cellule SP sono in grado di espellere rapidamente hoechst 33342. L’efflux di questo colorante è correlato ai trasportatori di cassette di legame ATP (ABC)13, che possono essere inibiti da alcuni agenti come Fumitremorgin C14,Verapamil e Reserpine15,16. Successivamente, diverse proporzioni di cellule SP sono state rilevate in una varietà di tessuti, organi, tessuti tumorali e linee cellulari tumorali17,18,19. Queste cellule SP hanno molte caratteristiche delle cellule staminali17,19.
Questo manoscritto descrive l’etichettatura e la colorazione hoechst 33342 delle cellule tumorali coltivate e l’analisi delle cellule SP per citometria del flusso. Inoltre, vengono mostrate l’ottimizzazione della concentrazione di Hoechst 33342 e la corretta selezione del bloccante per una specifica linea cellulare tumorale utilizzando questo approccio. Infine, vengono dimostrati gli effetti della promozione della staminalità o dei segnali di inibizione sulla proporzione di SP nelle cellule tumorali. Gli esempi sperimentali dimostrano che l’analisi della SP può essere utilizzata per esplorare gli effetti di vari segnali, come l’espressione genica, piccoli inibitori, attivatori, citochine e chemiochine, sulla staminali tumorale. Rispetto ad altri metodi per l’isolamento e la purificazione dei CSC, come lo smistamento di CD44+/CD24– popolazione, analisi dell’aldeide deidrogenasi (ALDH) e test di formazione della sfera tumorale, questo metodo è più facile da manipolazione ed è conveniente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi punti chiave da tenere a mente per il test SP. Il primo è la selezione di un blocco adeguato, come Verapamil o Reserpine, per ogni linea cellulare, perché la posizione “gate” delle celle SP è determinata in base alla posizione in cui un gran numero di cellule SP scompaiono dopo l’aggiunta del blocco. Per la linea di celle MDA-MB-231, Reserpine funziona bene. Tuttavia, per altre linee di celle, i blocchi diversi potrebbero funzionare meglio.
Il secondo è la concentrazione di…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla Natural Science Foundation of China 81572599, 81773124 e 81972787; Fondazione di Scienze Naturali della Città di Tianjin (Cina) 19JCYBJC27300; Tianjin People’s Hospital & Nankai University Collaborative Research Grant 2016rmnk005; Fondi di ricerca fondamentali per le università centrali, l’Università di Nankai 63191153.
Materials
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
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