고형 종양 세포주에서 측면 인구의 분석
Summary
고형 종양 세포주에서 측면 집단 세포의 비율을 측정하는 편리하고 빠르며 비용 효율적인 방법이 제시된다.
Abstract
암 줄기 세포 (CSC)는 종양 성장, 전이 및 재발의 중요한 원인입니다. CSC의 격리 및 식별은 종양 연구에 큰 의미가 있습니다. 현재, 몇몇 기술은 종양 조직 및 종양 세포주에서 CSC의 식별 그리고 정화를 위해 이용됩니다. 측면 집단(SP) 세포의 분리 및 분석은 일반적으로 사용되는 두 가지 방법이다. 이 방법은 HCs가 Hoechst 33342와 같은 형광 염료를 빠르게 추방하는 능력에 의존합니다. 염료의 efflux는 ATP 결합 카세트 (ABC) 수송기와 연관되고 ABC 수송 억제제에 의해 억제 될 수있다. Hoechst 33342를 사용하여 배양된 종양 세포를 염색하고 혈류 세포에 의한 SP 세포의 비율을 분석하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 분석은 편리하고 빠르며 비용 효율적입니다. 이 분석에서 생성된 데이터는 종양 세포의 줄기 특성에 대한 유전자 또는 기타 세포 외 및 세포 내 신호의 효과에 대한 더 나은 이해에 기여할 수 있습니다.
Introduction
암 줄기세포(CSC)는 자가 재생 능력과 여러 분화 잠재력을 가진 세포의 하위 집합으로 종양 성장, 전이 및 재발1,2에서중요한 역할을 한다. 현재 CSC는 폐, 뇌, 췌장, 전립선, 유방암 및간암3,4,5,6,7,8,9를포함한 다양한 악성종양에존재하는 것으로 확인되었습니다. 이들 종양에서 CSC의 식별은 주로 CD44, CD24, CD133 및 Sca-19,10의높은 및/또는 낮은 발현과 같은 표면 마커 단백질의 존재에 기초하지만, 비-CSC로부터 CSC를 구별할 수 있는 독특한 마커는 지금까지 보고되지 않았다. 현재, 몇몇 기술은 종양 조직 또는 종양 세포주에서 CSCs를 확인하고 정화하기 위하여 이용됩니다. 이러한 기술은 CS의 특정 특성을 기반으로 설계되었습니다. 그 중에서도, 측면 집단(SP) 세포의 소법과 정렬은 일반적으로 사용되는 두 가지 방법이다.
SP 세포는 원래 구델 외11에의해 발견되었다, 그들은 마우스 골수 세포에서 조혈 줄기 세포를 특성화 할 때. 마우스 골수 세포가 형광염 호흐트 33342로 표지되었을 때, Hoechst 33342 의 작은 그룹은 유동 세포 분석법의 2차원 도표 플롯에 나타났다. Hoechst 33342는 DNA 결합 염료이고 다른 스펙트럼 특성으로 이끌어 내는 적어도 2개의 결합 모드가 있습니다. 동시에 두 파장에서 형광 방출을 볼 때, 다중 인구는12를드러낸다. 이들의 분석에서 Hoechst 33342는 350nm에서 흥분되었고 형광은 450/20 nm 대역 패스(BP) 필터 및 675 nm 엣지 필터 롱패스(EFLP)11을사용하여 측정하였다. 골수 세포의 전체 인구와 비교하여, 세포의이 그룹은 SP 세포(11)에게불린 조혈 줄기 세포로 풍부하게 되었다. SP 세포는 Hoechst 33342를 급속하게 추방할 수 있습니다. 이 염료의 효능은 ATP 결합 카세트 (ABC)수송기 (13)와관련이 있으며, 이는 Fumitremorgin C14,Verapamil 및 Reserpine15,16과같은 일부 에이전트에 의해 억제 될 수 있습니다. 그 후, SP 세포의 상이한 비율은 다양한 조직, 장기, 종양 조직 및 종양 세포주17,18,19에서검출되었다. 이들 SP 세포는줄기세포(17,19)의많은특성을갖는다.
이 원고는 Hoechst 33342 의 배양 된 종양 세포의 라벨링 및 염색 및 유동 세포측정에 의한 SP 세포의 분석을 설명합니다. 더욱이, 이러한 접근법을 이용하여 특정 종양 세포주에 대한 Hoechst 33342 농도 및 적절한 차단제 선택의 최적화가 도시된다. 마지막으로, 종양 세포에서 SP의 비율에 대한 줄기 촉진 또는 억제 신호의 효과가 입증된다. 실험적인 예는 SP의 분석이 종양 줄기에 유전자 발현, 작은 억제제, 활성제, 사이토카인 및 화학과 같은 다양한 신호의 효과를 탐구하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. CD44 +/CD24의 정렬과 같은 CSC의격리 및 정화를 위한 다른 방법에 비해 인구, 알데히드 탈수소효소(ALDH) 분석 및 종양 구형성 분석, 이 방법은 조작이 용이하며 비용 효율적입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SP 분석기의 경우 몇 가지 핵심 사항이 있습니다. 첫 번째는 각 세포주에 대해 베라파밀 또는 레서핀과 같은 적절한 차단제의 선택이며, SP 세포의 “게이트” 위치는 차단기의 첨가 후 많은 수의 SP 세포가 사라지는 위치에 따라 결정되기 때문이다. MDA-MB-231 세포주, 레서핀은 잘 작동합니다. 그러나, 다른 세포주에 대 한, 다른 차단제 더 나은 작동 수 있습니다.
두 번째는 Hoechst 3334…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 81572599, 81773124, 81972787 대한 중국 자연과학 재단의 지원을 받았습니다. 천진시 자연과학재단(중국) 19JCYBJC27300; 천진인민병원 & 난카이대학 협력연구보조금 2016rmnk005; 중앙 대학, 난카이 대학 63191153 대한 기본 연구 기금.
Materials
| 6 well cell culture plate | CORNING | 3516 | 9.5 cm2 (approx.) |
| Colivelin | MCE | HY-P1061A | Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-Gly-Ala-Ser-Arg-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries (BIOIND) | 04-001-1ACS | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD LSRFortessa | |
| Flow cytometer software | BD Biosciences | FACSDiva | |
| Flow cytometry analysis software | BD Biosciences | FlowJo | |
| Hoechst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride |
| Polystyrene round bottom test tube | CORNING | 352054 | 12 x 75 mm, 5mL |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 3,8-Diamino-5-[3-(diethylmethylammonio)propyl]-6-phenylphenanthridinium diiodide |
| Reserpine | Sigma-Aldrich | 83580 | (3β, 16β, 17α, 18β, 20α)-11,17-Dimethoxy-18-[(3,4,5-trimethoxybenzoyl)oxy]yohimban-16-carboxylic acid methyl ester |
| SKLB816 | Provided by Dr. Shengyong Yang, Sichuan University | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V4629 | 5-[N-(3,4-Dimethoxyphenylethyl)methylamino]-2-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-isopropylvaleronitrile hydrochloride |
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