Vi præsenterer en metode, der kombinerer membran protein rensning og rekonstitution i peptidiscs i et enkelt kromatografisk trin. Biotinylerede stilladser anvendes til direkte overflade fastgørelse og måling af protein-ligand interaktioner via biolayer interferometri.
Membran proteiner, herunder transportører, kanaler og receptorer, udgør næsten en fjerdedel af cellulær proteom og over halvdelen af de nuværende narkotika-mål. Men en væsentlig barriere for deres karakterisering og udnyttelse i akademiske eller industrielle miljøer er, at de fleste biokemiske, biofysiske, og Drug screening strategier kræver disse proteiner til at være i en vandopløselig tilstand. Vores laboratorium for nylig udviklet peptidisc, en membran mimetiske tilbyder en “one-size-passer-all” tilgang til problemet med membran protein opløselighed. Vi præsenterer her en strømlinet protokol, der kombinerer protein rensning og peptidisc rekonstitution i et enkelt kromatografisk trin. Denne arbejdsgang, kaldet PeptiQuick, gør det muligt at omgå dialyse og inkubation med polystyren perler, hvilket i høj grad reducere eksponeringen for vaskemiddel, proteindenaturering, og prøve tab. Når PeptiQuick udføres med biotinylerede stilladser, kan præparatet fastgøres direkte til streptavidin-belagte overflader. Det er ikke nødvendigt at biotinylere eller ændre membran protein målet. PeptiQuick er fremvist her med membranen receptor FhuA og antimikrobiel ligand colicin M, ved hjælp af biolayer interferometri til at bestemme den præcise kinetik af deres interaktion. Det konk øres, at PeptiQuick er en bekvem måde at forberede og analysere membran protein-ligand interaktioner inden for en dag i et vaskemiddel frit miljø.
Membran proteiner er ofte udelukket fra Drug eller antistof opdagelse forskningsprogrammer på grund af tilbøjeligheden af membran proteiner til at aggregere uden for lipidbilayer miljø, især i nærværelse af vaskemidler1. Derfor er der i de seneste år blevet udviklet flere membran mimetika (såkaldte stilladser) for at lette isolation og forhør af membran proteiner i et helt rengørings frit miljø (dvs. nanodiske, SMALPs, amphipols osv.) 2,3,4,5,6. Imidlertid kræver rekonstitution af membran proteiner i disse mimetika ofte omfattende optimering, hvilket er tidskrævende og generelt ledsaget af tab af protein opsving7,8. For at overvinde disse begrænsninger, har vores laboratorium for nylig udviklet en “one-size-passer-all” formulering kendt som peptidisc9. Peptidiscen dannes, når flere eksemplarer af en designer 4,5 kDa mole bihelical peptid binder sig til den hydrofobiske overflade af et målmembran protein. Stabil rekonstitution i peptidisc opstår ved fjernelse af vaskemiddel, idet både endogene lipider og solubilized membran proteiner kommer i vandopløselige partikler. Disse stabiliserede partikler er nu modtagelig for talrige downstream applikationer.
Peptidisc-metoden giver flere fordele; for eksempel er rekonstitution ligetil, da binding af peptidisc-stilladset på målet styres af selve protein skabelonen9,10. Peptidstøkiometri er også selv bestemt, og tilsætning af eksogene lipider er ikke nødvendig. Peptidisc dannelse sker ved simpel opløsning af vaskemiddel, en vigtig fordel i forhold til dialyse eller adsorptions på polystyren perler, som ofte resulterer i lavt proteinudbytte på grund af ikke-specifik overflade forening og sammenlægning11,12 ,13. Det endelige peptidisc-modul er meget termo stabilt og uvægerligt opløseligt i forskellige buffere eller i tilstedeværelse af Divalente kationer (f. eks. ni2 +). Den renhed og strukturelle homogenitet af stilladset er også høj (f. eks, endotoxin-fri), og peptid kan tilpasses med funktionelle grupper placeret på forskellige positioner.
Vi præsenterer her et laboratorium workflow kaldet PeptiQuick, også kendt som on-perler rekonstitution9. Denne protokol kombinerer membran protein rensning og peptidisc rekonstitution i et enkelt trin og på samme kromatografiske støtte. Som navnet antyder, PeptiQuick er hurtig sammenlignet med andre rekonstitutionsmetoder, og det også alvorligt reducerer eksponering tid til vaskemiddel. Negative vaskemiddel effekter såsom protein udfoldning og aggregering forekommer ofte på en tidsafhængig måde; Derfor er det afgørende at minimere eksponeringen for rengøringsmidler for at opretholde den oprindelige protein konstellation14,15. Dette er afgørende for nøjagtigheden af metoder, der rapporterer om protein interaktioner og ligand bindende tilhørsforhold.
Under udviklingen af denne protokol præsenterer vi den nye biotinylerede version af peptidisc-stilladset, kaldet bio-Peptidisc. Biotin funktionelle grupper tillader fastgørelse af målet membran protein på streptavidin-belagte overflader. Da biotin mærkning er begrænset til stilladset, forbliver bindingssteder på målet membran protein uændret. Ved hjælp af bio-Peptidisc bestemmes den bakterielle membran receptor FhuA ‘ og antimikrobielle peptidcolicin M (ColM) bindings kinetik16. Denne affinitet måles via biolayer interferometri (bli), som analyserer interaktioner i realtid baseret på hvide lys interferens mønstre reflekteres fra en sensor spids.
Ved at bruge denne protokol elimineres behovet for vaskemiddel under BLI-analyse, hvilket er en vigtig udvikling, da rengøringsmidler kan forstyrre interaktioner. Bindende tilhørsforhold kan måles hurtigt med denne metode, og resultaterne er sammenlignelige med dem, der er rapporteret tidligere ved hjælp af nanoskiver og isotermisk titrering hele kroppen vha (ITC)16. De kritiske trin i PeptiQuick-arbejdsprocessen vises og diskuteres, såsom protein præparat, fortynding af vaskemiddel, peptid addition og rekonstitution sammen med tip til fejlfinding af ligand og analysand binding i BLI-analysen. Ved hjælp af PeptiQuick arbejdsgang, det er konstateret, at membran proteiner kan fanges i peptidiscs og deres interaktioner måles inden for en dag.
Mens vaskemidler forbliver den enkleste metode til at udtrække og rense membran proteiner, kan disse overfladeaktive stoffer have mange uønskede virkninger på protein stabilitet, funktion og downstream-analyser1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Disse vanskeligheder har motiveret udviklingen af membran mimetika, som stræber efter at minimere tilstedeværelsen af rengøringsmidler og replikerer det oprindelige membran miljø så meget som muligt2,3,4 ,5,6. Størstedelen af rekonstitutionsmetoderne kræver dog en betydelig optimering af rekonstitutionsforholdene og kræver ofte yderligere rensningstrin, hvilket mindsker det endelige udbytte på7,8. Peptidisc spontant tilpasser sig målet membran protein og forholdsvis, kræver lidt optimering og downstream rensning9,10. I denne protokol præsenteres PeptiQuick som et simpelt middel til at strømline rekonstitutionsprotokollen til downstream-protein-protein interaktions analyse.
Selv om det er ligetil, er der flere eksperimentelle advarsler, der kan føre til mislykket rekonstitution. Blandt disse, den mest almindeligt skyldes protein aggregering. Det er derfor afgørende at udføre størrelses ekskluderings kromatografi for at overvåge rekonstituationsprocessen. For eksempel er en størrelses udelukkelse peak eluering ved Void volumen indikerer protein aggregater (figur 3b)17,18. Membran protein aggregater dannes typisk ved længerevarende udsættelse for suboptimale vaskemiddel forhold før rekonstitution. Det er især blevet konstateret, at membran proteiner i vaskemiddel har tendens til at danne aggregater, når de er koncentreret ved ultrafiltrering på centrifugal anordninger. I dette tilfælde kan følsomme membran proteiner koncentreres ved hjælp af vakuum ultra-filtrering, en blidere og mere homogen koncentrations metode, da adsorptions af proteiner til filteret er formindsket.
For at undgå proteinkoncentration bør de eluerede IMAC-fraktioner generelt samles, og en alikvot injiceres på en kolonne med størrelses udelukkelse for at kontrollere dens rekonstitutionskvalitet. Det skal bemærkes, at uindarbejdet gratis peptid elutter lige efter den vigtigste peptidisc Peak (figur 3b). Det frie stilladser hindrer ikke nødvendigvis downstream-eksperimenter. Men hvis det er nødvendigt, kan dette overskydende fjernes ved størrelses udelukkelse kromatografi. Alternativt, øge vaske volumen under rekonstitution, og før eluering fra IMAC harpiks, er nok til effektivt at fjerne det meste af det frie peptidisc peptid. Derfor anbefales størrelses udelukkelse kromatografi som en hurtig og enkel måde at kontrollere rekonstitution kvalitet.
BLI-eksperimentet kræver omhyggelig optimering af både ligand-og analysand-koncentrationer. Ligand binding skal være tilstrækkelig til at opnå et klart signal, men overbelastning vil forårsage signal mætning, hvilket resulterer i data artefakter fra overbelægning og sterisk hindring på spidsen overfladen. Derfor skal både koncentrationen af ligand og længden af tid spidsen tilbringer i ligand opløsningen optimeres for hver protein prøve (supplerende figur 2). Analysand koncentrationen skal også optimeres. Hvis dissociations konstanten er kendt, bliver dette trin lettere, da koncentrationsintervallet kan tilnæres. Et godt udgangspunkt for denne analyse er at bruge proteinkoncentrationer mellem 0,1 og 20 gange den forventede Kd19.
Efter BLI data Acquisition skal der foretages omhyggelig dataanalyse for at undgå fejlfortolkninger. Beregningen af dissociations konstanten afhænger af en bindings kurves pasform. Medmindre bindende støkiometri allerede er kendt, en klassisk 1:1 interaktion interaktions model bør anvendes til den indledende montering. Det skal bemærkes, at en heterogen bindings kurve ofte er resultatet af artefakter og ikke-ideal adfærd forårsaget af høj analysand koncentration, som kan misfortolkes som en kompleks bindings model. Derfor, sænke analysand koncentrationen indtil sensorgram profil viser 1:1 binding støkiometri kan hjælpe med at skelne heterogene binding fra mere komplekse interaktioner. Eventuelle resterende heterogene bindings data diskonteres derefter som vist i figur 420.
I denne rapport måles en dissociationskonstant på 2,28 ± 0,74 nM for FhuA-ColM-interaktionen. Denne værdi er i overensstemmelse med den dissociationskonstant, der tidligere blev fastlagt i vores gruppe med nanodisc eller peptidisc med henholdsvis ITC eller MST (figur 4E)16. Denne konsistens giver tillid til peptidisc rekonstitution og BLI analyse som et middel til at bestemme interaktions kinetik. Det er vigtigt at bemærke, at proteiner normalt er immobiliseret på streptavidin biosensorer enten gennem biotin kemisk Cross-Linking eller site-specifikke tilsætning ved hjælp af E. coli biotin Ubiquitinligase BirA21. Åbenbart, biotinylating peptidisc stilladset, i stedet for målet membran protein, har mange fordele. Stillads biotinylering sparer tid og minimerer potentialet til at forstyrre vigtige protein bindingssteder. Vi har også konstateret, at PeptiQuick er gældende for en bred vifte af protein Target klasser, herunder G-protein-koblede receptorer (GPCRs), Ion-kanaler, og β-Tønder membran proteiner. Generelt skal det bemærkes, at det oprindelige vaskemiddel ekstrakt af membran proteiner i en aggregat-fri tilstand er kritisk, og at umiddelbar rekonstitution i peptidisc nedsætter downstream-Akkumulerings problemer. I betragtning af den enkelhed, det er forestillede, at PeptiQuick vil blive udvidet til andre streptavidin-baserede bindende assays, såsom overflade Plasmon resonans (SPR), ELISA assays, og affinitet pull-Downs ved hjælp af streptavidin perler.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. JS besidder en CGS-M CIHR stipendium. LT blev støttet af Forskningsrådet for bioteknologi og biologisk videnskab, finansieret South West Biosciences ph. d.-UDDANNELSESPARTNERSKAB [uddannelse Grant reference BB/M009122/1]. FD er en tier II Canada-forsknings stol.
30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | – |
Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | – |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | – |
Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | – |
Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | – |
Protein Assay Dye – Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration – 5x concentration |
Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | – |
Thiamine | Merck | 69271 | – |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | – |