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Article de méthode

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Préparation pour l'étude fonctionnelle

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DOI :

10.3791/60676

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18 décembre 2019

 ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Neurological Sciences, University of Vermont Larner College of Medicine, 3Department of Pharmacology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Dans cet article

Résumé

Le présent manuscrit détaille comment isoler les artérioles et les capillaires hippocampiques du cerveau de la souris et comment les pressuriser pour la myographie sous pression, l'immunofluorescence, la biochimie et les études moléculaires.

Résumé

Des altérations comportementales subtiles à la démence de phase tardive, l'affaiblissement cognitif vasculaire se développe typiquement suivant l'ischémie cérébrale. L'aVC et l'arrêt cardiaque sont des maladies dimorphiques remarquablement sexuellement, et les deux induisent l'ischémie cérébrale. Cependant, les progrès dans la compréhension de l'affaiblissement cognitif vasculaire, et puis développant des traitements sex-spécifiques, ont été en partie limités par des défis en étudiant la microcirculation de cerveau des modèles de souris dans les études fonctionnelles. Ici, nous présentons une approche pour examiner la signalisation capillaire-à-arteriole dans un artériole capillaire-parenchymal ex vivo (HiCaPA) préparation du cerveau de souris. Nous décrivons comment isoler, canuler, et pressuriser la microcirculation pour mesurer le diamètre artériolaire en réponse à la stimulation capillaire. Nous montrons quels contrôles fonctionnels appropriés peuvent être utilisés pour valider l'intégrité de préparation HiCaPA et afficher des résultats typiques, y compris l'essai de potassium comme agent de couplage neurovasculaire et l'effet de l'inhibiteur récemment caractérisé de la famille de canaux de potassium rectifiant s'intériorisent Kir2, ML133. En outre, nous comparons les réponses dans les préparations obtenues des souris mâles et femelles. Bien que ces données reflètent des études fonctionnelles, notre approche peut également être utilisée dans les études de biologie moléculaire, d'immunochimie et d'électrophysiologie.

Introduction

La circulation piale à la surface du cerveau a fait l'objet de nombreuses études, en partie en raison de son accessibilité expérimentale. Cependant, la topologie de la vascularisation cérébrale crée des régions distinctes. Contrairement au solide réseau pial riche en anastomoses avec une capacité substantielle pour rediriger le flux sanguin, les artérioles parenchymales intracérébrales (PA) présentent un approvisionnement collatéral limité, chacun d'eux perfusant un volume discret de tissu nerveux1,2. Cela crée un effet de goulot d'étranglement sur le flux sanguin qui, combiné avec des caractéristiques physiologiques uniques3,4,5,6,7,8, fait artérioles intracérébrales un site crucial pour le flux sanguin cérébral (CBF) régulation9,10. Malgré les défis techniques inhérents à l'isolement et à l'annulation des AP, la dernière décennie a vu un intérêt accru pour les études fonctionnelles ex vivo à l'aide de navires pressurisés11,12,13,14,15,16,17. Une des raisons de cet intérêt accru est l'effort considérable de recherche mené sur le couplage neurovasculaire (NVC), le mécanisme soutenant l'hyperémie fonctionnelle de cerveau18.

À l'échelle régionale, le CBF peut augmenter rapidement après l'activation neuronale locale19. Les mécanismes cellulaires et les propriétés de signalisation contrôlant NVC sont incomplètement compris. Cependant, nous avons identifié un rôle précédemment imprévu pour les capillaires de cerveau pendant NVC en sensibilisant l'activité neurale et en la traduisant dans un signal électrique hyperpolarisant pour dilater les artérioles en amont20,21,22. Potentield d'action23,24 et l'ouverture des canaux de grande conductance Ca2-activéK(BK) sur les pieds d'extrémité astrocytiques25,26 augmentent la concentration interstitielle d'ions de potassium [K-]o, qui a comme conséquence l'activation des canaux intérieurs forts de rectifier K(Kir) dans l'endothelium vasculaire des capillaires. Ce canal est activé park externe mais aussi par hyperpolarisation elle-même. Se propageant à travers les jonctions d'écart, le courant hyperpolarisant se régénère alors dans les cellules endothéliales capillaires adjacentes jusqu'à l'artériole, où il provoque la relaxation de myocyte et l'augmentation de CBF20,21. L'étude de ce mécanisme nous a menés à développer une préparation pressurisée d'artériole capillaire-parenchymal (CaPA) pour mesurer le diamètre artériolar pendant la stimulation capillaire avec des agents vasoactifs. La préparation de CaPA est composée d'un segment d'artériole intracérébrale cannulated avec une ramification capillaire intacte et en aval. Les extrémités capillaires sont comprimées contre le fond de verre de la chambre par une micropipette, qui occludes et stabilise toute la formation vasculaire20,21.

Nous avons précédemment fait des innovations instrumentales en imagerie des préparations CaPA à partir du cortex de souris20,21 et les artérioles du rat amygdale13 et hippocampe16,17. Comme la vascularisation hippocampal reçoit plus d'attention en raison de sa susceptibilité aux conditions pathologiques, ici nous fournissons une méthode étape par étape pour la préparation de CaPA de l'hippocampe de souris (HiCaPA) qui peut non seulement être employée dans les études fonctionnelles de NVC mais également dans la biologie moléculaire, l'immunochimie, et l'électrophysiologie.

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Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l'Université du Colorado, Anschutz Medical Campus et ont été effectuées selon les directives des National Institutes of Health.

1. Solutions

  1. Utilisez la saline tamponnée MOPS pour la dissection et pour conserver les échantillons à 4 oC avant leur utilisation. Ne pas gazer la solution. Préparer moPS tamponné saline avec composition suivante: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM glucose, 3 mM MOPS, 0,02 mM EDTA, 2 mM pyruvate, 10 mg/mL sérique albumin, pH 7,3 à 4 oC.
  2. Utilisez le liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) comme solution de bain et de pipette. Gaz aCSF et Ca 2 -aCSF libre avec 5% CO2, 20% O2, et N2 solde. Préparer la solution avec la composition suivante: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 4 mM glucose, 2 mM CaCl2, pH 7,3 (avec aération avec 5% CO2, 20% O2, et N2 équilibre).
  3. Obtenir la dilatation maximale en nominalement Ca2-free aCSF (0 mM [Ca2 '] o, 5 mM EGTA).

2. Préparation de chambre d'organe

  1. Insérer des capillaires en verre borosilicate (diamètre extérieur de 1,2 mm; diamètre intérieur à 0,69 mm; longueur de 10 cm) dans un tire-verre. Tirez le capillaire pour faire une pointe longue et mince à une extrémité.
  2. D'un côté de la chambre, ajoutez une canule qui peut se connecter à une pompe péristtaltique miniature pour pressuriser le navire. Sous un microscope de dissection, casser la pointe de la canule de sorte qu'il soit assez petit pour s'adapter au récipient d'intérêt, mais assez grand pour permettre aux solutions de circuler à travers la pointe. Assurez-vous que la pointe a un diamètre d'environ 10 à 15 m.
  3. Remplissez la canule à l'aide d'une seringue à l'aide d'un filtre de 0,22 m attaché avec de l'aCSF oxygéné. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air ou de débris dans la canule.
  4. Ajouter deux autres canules de l'autre côté de la chambre. Ne cassez pas leurs pourboires.

3. Dissection et isolement d'Hippocampe

  1. Euthanasier et décapiter une souris. Pour cette expérience, utilisez une souris C57BL6/J de 8 semaines pour comparer les différences entre les mâles et les femelles. Injecter la souris avec du pentobarbital et décapiter avec des ciseaux chirurgicaux.
  2. À l'aide de petits ciseaux de dissection, couper la peau le long de la ligne médiane au sommet de sa tête. Déplacez la peau sur les côtés.
  3. À partir du côté caudal du crâne, couper le crâne le long de la ligne médiane jusqu'à ce que les ampoules olfactives sont atteints. Enlever les parties du crâne jusqu'à ce que le cerveau soit exposé.
  4. Enlevez lentement le cerveau, en commençant près du nez de la souris. Séparez le cerveau des ampoules olfactives, des nerfs crâniens et de la moelle épinière en coupant à travers les structures avec les petits ciseaux de dissection.
  5. Placez le cerveau dans une plaque de dissection avec une solution MOPS suffisante pour le submerger complètement. À l'aide d'un microscope à dissection, placez le cerveau au centre de la plaque de dissection avec le côté ventral vers le bas.
  6. À l'aide d'une lame de rasoir, couper le cerveau en deux le long de la fissure longitudinale. Maintenez la lame de sorte que le bord tranchant soit parallèle au fond de la plaque de dissection. Appuyez la lame à travers le cerveau d'un seul coup. Déplacer un hémisphère sur le côté de la plaque.
  7. Effectuez les étapes suivantes pour chaque hémisphère séparément ou en parallèle.
    1. Placez un hémisphère au centre de la plaque de sorte que la ligne médiane est orientée vers le bas. Ensuite, utilisez la lame de rasoir pour couper le long de la fissure transversale pour enlever le cervelet et le tronc cérébral. Poussez la lame directement à travers le tissu.
    2. Faites pivoter l'hémisphère de sorte que le côté médial soit orienté vers le haut (Figure 1A). Utilisez une spatule pour maintenir le cerveau en place. À l'aide d'une deuxième spatule, insérez la pointe sous le corpus callosum et pellez en dessous pour enlever le thalamus, le septum et l'hypothalamus, couvrant l'hippocampe (figure 1B).
    3. Assurez-vous que l'hippocampe est maintenant visible sous forme de structure incurvée près du côté postérieur du cerveau. À l'aide d'une spatule pour maintenir le cerveau en place, utiliser la deuxième spatule pour extraire l'hippocampe du cerveau (Figure 1C).
  8. Transférer l'hippocampe dans une nouvelle plaque de dissection remplie à mi-chemin de la solution MOPS. Jetez le reste du cerveau.

4. Isolement artériole hippocampal

  1. Complétez les étapes suivantes pour chaque hippocampe.
    1. Épinglez l'un des hippocampi à l'aide de petites broches à chaque extrémité de la section. L'artère hippocampique est orientée vers le haut.
    2. À l'aide de forceps très pointus, étirer délicatement de petites sections de l'hippocampe. Cela va desserrer le tissu entourant les artérioles, ce qui rend plus facile de les disséquer.
    3. Rechercher à travers le tissu hippocampique dorsal pour identifier l'artère transversale externe (Figure 1C)16,27.
    4. Saisissez doucement l'artère transversale externe et éloignez-la lentement du tissu pour recueillir les artérioles et les capillaires perfusant la région CA3 de l'hippocampe.
    5. Une fois qu'il n'y a plus de vaisseaux à enlever du tissu, jetez l'hippocampe. Gardez les navires sur la glace dans des plaques pendant qu'ils ne sont pas utilisés.

5. Hippocampal capillaire-parenchymal arteriole cannulation

  1. Trouvez une artériole avec une branche qui se termine par des capillaires. Transférez-le à la chambre d'orgue. Assurez-vous que l'artériole est d'environ 15-30 m lorsqu'il est complètement dilaté (Figure 1D).
  2. Montez soigneusement le vaisseau sanguin en poussant la pointe de la canule à travers la paroi artériole en dessous de la zone cible. Faites glisser soigneusement le récipient sur la canule jusqu'à ce qu'il y ait assez de tissu pour placer la cravate.
  3. Faire un noeud lâche avec 12-0 sutures en nylon de sorte qu'il s'adapte sur le vaisseau sanguin et la canule. Utilisez un demi-noeud pour fixer les liens. Puis tirez les extrémités pour serrer le noeud et fixer l'artériole à la canule. Retirez toutes les branches de navire extra-terrestres sous la cravate en les tirant doucement avec des forceps.
  4. Faites une autre cravate et fixez-la à l'autre extrémité de l'artériole pour la sceller.
  5. Baisser la canule avec le récipient attaché jusqu'à ce qu'elle soit plate contre la glissière de couverture au fond de la chambre. Veillez à ne pas abaisser la canule trop ou il se cassera.
  6. À l'aide d'une canule de l'autre côté de la chambre, abaissez-la de sorte que le point de celui-ci épingle la cravate à l'extrémité de l'artériole.
  7. Utilisez la troisième canule pour épingler la branche capillaire à la couverture. Placez la pointe près de l'extrémité de la branche tout en laissant les extrémités des capillaires exposés (pas sous la canule).

6. Myographie de pression

  1. Déplacez la chambre de la portée de dissection au microscope avec le logiciel d'enregistrement.
  2. Connectez l'entrée et le tube d'écoulement à la chambre pour la perfusion. Démarrer la perfusion avec un aCSF chauffé (37 oC) à un débit de 4 ml/min.
  3. Fixez la canule pressurisante à une pompe péristaltique jumelée à un transducteur de pression et amenez la pression interne à 20 mm Hg.
  4. Démarrez le logiciel d'enregistrement. Ajustez les réglages du microscope et de l'imagerie pour obtenir l'image la plus claire possible. Commencez l'enregistrement une fois que les paramètres sont optimisés pour le logiciel de détection.
  5. Augmentez la pression du navire jusqu'à 40 mm Hg tout en enregistrant le diamètre artériel avec un logiciel de détection des bords.
  6. Laisser la solution MOPS de 15 à 20 min pour laver la solution MOPS de la chambre avec aCSF, et laisser la préparation HiCaPA pour équilibrer et développer le ton myogénique.
  7. Pour vérifier la viabilité d'un navire, appliquez une solution NS309 de 1 M À la perfusion du bain (voir la figure 2A,B et la section Résultats représentatifs). Le segment artériolaire doit se dilater, démontrant environ 30-40% de tonalité myogène comme précédemment décrit3,14,20.

7. Stimulation focale des extrémités capillaires

  1. Une fois que le ton de base pour l'artériole a été établi et la fonction endothéliale évaluée, testez la réponse de la stimulation capillaire.
  2. À l'aide d'un tire-lait en verre, faire des canules afin qu'il y ait un point fin à une extrémité. Briser la pointe d'une canule de sorte que le médicament testé peut circuler à travers la pointe en douceur à 5 psi.
  3. Remplissez la canule avec la solution médicamenteuse d'intérêt et ajoutez-la à un micromanipulateur à 3 axes attaché au microscope. Connectez le tube du système d'éjection de pression à la canule.
  4. Abaissez lentement la canule dans le bain près des capillaires, en prenant soin de ne pas heurter une partie du navire ou du matériel dans la chambre. Manœuvrer la pointe de la canule à côté des extrémités des capillaires sans les toucher. Gardez la pointe de la canule juste à l'écart de la glissière de couverture pour empêcher le navire d'être stimulé si la canule fuit.
  5. Lorsque vous êtes prêt à stimuler les capillaires, abaisser la canule à la couverture et juste à côté des capillaires. Activer le système d'éjection de pression avec le temps d'éjection souhaité (ici 20 s). Une fois la stimulation terminée, soulevez légèrement la canule pour éviter une stimulation supplémentaire.
  6. Répétez la stimulation au besoin. Modifier la canule du système d'éjection de pression pour tester différents composés médicamenteux.
  7. Pour confirmer que seuls les capillaires sont stimulés, remplissez la canule d'une solution NS309 de 1 M et répétez les étapes ci-dessus.
    REMARQUE : Les cellules endothéliales capillaires n'expriment pas les canaux Ket Activés par NS309, de sorte que l'artériole ne doit pas répondre à la stimulation. Si l'artériole se dilate, la canule devra être repositionnée ou le diamètre du trou devra être plus petit (voir la figure 2A,B et la section Résultats représentatifs).

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Résultats

Les canaux endothélial de petite conductance (SK) et de conduite intermédiaire (IK) Ca2'sensiblesK', exercent une influence dilatoire sur le diamètre des AP. L'application de bain de 1 M NS309, un agoniste synthétique de canal IK et SK, a causé la dilatation presque maximale (figure 2A,B). Cependant, les cellules endothéliales capillaires manquent de canaux IK et SK et n'ont pas hyperpolarisé en réponse à NS309

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Discussion

La préparation sous pression HiCaPA (artériole capillaire-parenchymale hippocampal) décrite dans le présent manuscrit est une extension de notre procédure bien établie pour isoler, pressuriser et étudier les artérioles parchymales29. Nous avons récemment rapporté que les canaux Kir2.1 dans les cellules endothéliales capillaires du cerveau sentent des augmentations dans [K'] o associés à l'activation neurale, et génèrent un signal hyperpolarisant ascendant qui dilate les artér...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Les auteurs tient à remercier Jules Morin pour ses commentaires perspicaces sur le manuscrit. Cette recherche a été financée par des prix de l'organisme à but non lucratif CADASIL Together We Have Hope, du Center for Women's Health and Research et du NHLBI R01HL136636 (FD).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 et micro ; m Filtres pour seringuesCELLTREAT Scientific Products229751
12-0 Nylon (12cm) NoirMicrosurgery Instruments, IncS12-0 NYLON
Régulateur automatique de températureWarner InstrumentsTC-324B
Verre borosilicaté D.E. : 1,2 mm, D.I. : 0,68 mmSutter InstrumentsB120-69-10
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA7030
CaCl2 dihydratéSigma-AldrichC3881
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG5767
Lunette de dissectionOlympusSZ11
ECOLINE VC-MS/CA 4-12 &mdash ; Pompe complète avec entraînement et tête de pompe MS/CA 4-12IsmatecISM 1090
EGTA Sigma-AldrichE4378
Ciseaux fins - SharpFine Science Tools14063-09
Chauffe-eau en ligneWarner InstrumentsSH-27B
Integra&trade ; Miltex&commerce ; Pince à tissusFisher Scientific12-460-117
KClSigma-AldrichP9333
KH2PO4Sigma-AldrichP5379
Sulfate de magnésium heptahydratéSigma-AldrichM1880
MgCl AnhydrusSigma-AldrichM8266
MicromanipulateurNarishigeMN-153
ML 133chlorhydrate Tocris4549
MOPSSigma-AldrichM1254
NaClSigma-AldrichS9625
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638
NaHCO3Sigma-AldrichS8875
NS309Tocris3895
Picospritzer III - Systèmes de distribution par micro-injection intracellulaire, 2 canauxParker Hannifin052-0500-900
Servocontrôleur de pression avec pompe péristaltiqueSystèmes vivants
Pyruvate de sodiumSigma-AldrichP3662
Pince super fineFine Science Tools11252-20
Ciseaux chirurgicaux - Sharp-BluntFine Science Tools14001-13
Extracteur de micropipette verticalNarishigePP-83
Instrumentation PS-200

Références

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