Dans ce protocole, une méthode d’isolement et de transplantation d’îlot de murine dans le tissu sous-cutané sous-cutané inguinale d’adipeux est décrite. Des îlots murines syngénéiques isolés sont transplantés dans un récipient de murine utilisant un hydrogel de membrane de sous-sol. Le taux de glucose sanguin des receveurs est surveillé, et l’analyse histologique des greffes d’îcles est effectuée.
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Article de méthode
Modèle de transplantation inguinal Subcutaneous De tissu adipeux blanc (ISWAT) des îlots de Murine
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La transplantation d’îlot pancréatique est un traitement thérapeutique bien établi pour le diabète de type 1. La capsule rénale est le site le plus couramment utilisé pour la transplantation d’îlots dans les modèles de rongeurs. Cependant, la capsule rénal serrée limite la transplantation d’îlots suffisants chez les grands animaux et les humains. Le tissu adipeux blanc sous-cutané inguinal (ISWAT), un nouvel espace sous-cutané, s’est avéré être un site potentiellement valable pour la transplantation d’îlots. Ce site a un meilleur approvisionnement en sang que d’autres espaces sous-cutanés. En outre, l’ISWAT accueille une plus grande masse d’îlot que la capsule rénale, et la transplantation en elle est simple. Ce manuscrit décrit la procédure de l’isolement et de la transplantation d’îlots de souris dans le site ISWAT des destinataires diabétiques syngénétiques de souris. Utilisant ce protocole, les îlots pancréatiques murines ont été isolés par la digestion standard de collagène et un hydrogel de matrice de membrane de sous-sol a été employé pour fixer les îlots purifiés dans le site d’ISWAT. Les niveaux de glucose sanguin des souris destinataires ont été surveillés pendant plus de 100 jours. Des greffes d’îlot ont été récupérées au jour 100 après transplantation pour l’analyse histologique. Le protocole de transplantation d’îlots dans le site ISWAT décrit dans ce manuscrit est simple et efficace.
Introduction
L’incidence et la prévalence mondiales du diabète sucré de type 1 (T1DM) augmentent rapidement, selon les données statistiques de la Fédération internationale du diabète (FDI)1. La transplantation d’îlots est l’une des approches les plus prometteuses pour le traitement du T1DM4. Puisque la grande percée faite dans la transplantation clinique d’îlot utilisant le protocole2 d’Edmonton a été rapportée, la survie fonctionnelle de greffe d’îlot dans des destinataires de T1DM après 5 ans atteint maintenant environ 50%3.
Dans le passé, plusieurs sites d....
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Protocole
Toutes les procédures de ce protocole ont suivi les principes du bien-être animal du Comité d’examen de l’éthique du Shenzhen Second People’s Hospital. Les receveurs et les donneurs de greffe d’ît étaient des souris mâles C57BL/6 de 8 à 10 semaines achetées au Centre des animaux médicaux de la province du Guangdong. La procédure de récolte, d’isolement, de culture ou d’administration des cellules récoltées a été effectuée dans des conditions aseptiques.
1. Préparation des islets
- Préparer une solution de travail de type V de collagène. Peser la collagène de type V et dissoudre avec le tampon de D-Hank à une concentration finale de ....
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Résultats
Deux procédures sont introduites dans ce protocole : la préparation des îlots murines et la transplantation d’îlots sur le site de l’ISWAT. Dans la première procédure, après avoir perfusé et digéré avec la solution de collagène de type V, purifiant avec Histopaque-1119 et Histopaque-1077 et une étape supplémentaire de cueillette à la main, les îlots de murine isolés seront suffisamment purs pour la transplantation (comme indiqué dans la figure 1) et les îlots isolés qui ont une viabilité éle.......
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Discussion
La transplantation d’îlot de pancréas est une thérapie prometteuse pour traiter T1DM. L’effet de cette thérapie est affecté par de nombreux facteurs et le choix d’un site optimal pour l’implantation des îîaux est extrêmement important. Le site anatomique idéal pour la transplantation d’îlots devrait avoir les caractéristiques suivantes : accessibilité pour la transplantation simple, la biopsie, et les procédures de récupération de greffe ; complications réduites; taux de réussite élevé du contrôle de la glycémie; et la s.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions du National Key R-D Program of China (2017YFC1103704)Fonds spéciaux pour la construction d’hôpitaux de haut niveau dans la province du Guangdong (2019), Sanming Project of Medicine à Shenzhen (SZSM201412020), Fonds pour le haut niveau Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZ Fondation de recherche scientifique de la province du Guangdong en Chine (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,22 &mu ; m Unité de filtration entraînée par seringue | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| Tube à centrifuger 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Pipette Pasteur 5 mL | JingAn Biological, Chine | J00085 | |
| Seringue de 5 mL | Szboon, Chine | 20170829 | |
| Tube conique de 50 mL | Corning | 430829 | |
| 5-0 suture chirurgicale | sh-Jinhuan, Chine | CR537 | |
| Seringue de 60 mL | Szboon, Chine | 20170623 | |
| 75 % d’éthanol | LIRCON, Chine | 9180527 | |
| Alexa Fluor 488 âne anti-souris IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
| anti-souris Anticorps anti-glucagon | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
| anti-souris | insuline anticorps Cell Technologie de signalisation | 3014s | Dilution (1:100) |
| aiguille de perfusion à pointe émoussée | Oloey, Chine | 005 | 32G, jaune |
| BSA | Meilune, Chine | MB4219 | |
| C57BL/6 Souris | médical pour animaux de la province | 8 ~ 10 semaines | |
| boîte de culture cellulaire | BIOFIL, Chine | TCD000100 | Général, Non traité, 87,8 mm de diamètre |
| centrifugeuse | Thermo Scientific | ST16R | |
| céphalosporine | Lukang medical, Chine | 150303 | |
| CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
| Codos Pet Clipper | Szcodos, Chine | CP-8000 | |
| collagénase Type V | Sigma | C9262 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Tampon D-hank | Coolaber, Chine | PM5140-10 | |
| dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
| Média de coloration à l’éosine | Beyotime Biotech, Chine | C0109 | |
| FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| diacétate de fluorescéine (FDA) | Thermo Fisher | Microscope fluorescent F1303 | |
| Leica | DMIL | ||
| pointes de pipette à chargement de gel | Corning | CLS4884 | |
| HBSS | Coolaber, Chine | PM5150-10 | |
| Média de coloration à l’hématoxyline | Technologie de signalisation cellulaire | 14166S | |
| HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
| HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
| Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Matrice de membrane basale |
| Iodophor | LIRCON, Chine | 5190313 | |
| plat de culture étanche à la lumière | DVS, Chine | AN-5058548 | auto-fabriqué, plat en verre pulvérisé de peinture |
| noire Ruban adhésif médical | Cofoe, Chine | K12001 | |
| micropince à épiler non invasive | RWD Life Science | F11033-11 et F12016-15 | |
| One Touch ultraeasy Système de base de surveillance de la glycémie | Johnson & Ciseaux | 33391713 | |
| RWD Life Science | S12012-12 et S11001-08 | ||
| P/S (pénicilline / streptomycine) | Gibco | 15140-122 | |
| pentobarbital sodique | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Iodure de propidium | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| STZ (streptozotocine) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
| Bandelette de test | GenUltimate | 100-50 | |
| TRITC-conjuguée chèvre anti-lapin IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
| pince vasculaire | RWD Life Science | R31006-04 |
Références
- Cho, N. H., et al. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Shapiro, A. M., et al.
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Réimpressions et autorisations
