Détection des espèces réactives totales d’oxygène dans les cellules adhérentes par 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacétate Staining

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour détecter l’espèce totale d’oxygène réactif cellulaire (ROS) à l’aide de 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA). Cette méthode permet de visualiser la localisation cellulaire de ROS dans les cellules adhérentes avec un microscope à fluorescence et de quantifier l’intensité de ROS avec un lecteur de plaque de fluorescence. Ce protocole est simple, efficace et rentable.

Abstract

Le stress oxydatif est un événement important dans des conditions physiologiques et pathologiques. Dans cette étude, nous démontrons comment quantifier le stress oxydatif en mesurant l’espèce réactive totale d’oxygène (ROS) en utilisant 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DCFH-DA) coloration dans les lignées cellulaires cancéreuses colorectales à titre d’exemple. Ce protocole décrit des étapes détaillées comprenant la préparation de la solution DCFH-DA, l’incubation des cellules avec la solution DCFH-DA, et la mesure de l’intensité normalisée. La coloration DCFH-DA est un moyen simple et rentable de détecter le ROS dans les cellules. Il peut être utilisé pour mesurer la génération de ROS après un traitement chimique ou des modifications génétiques. Par conséquent, il est utile pour déterminer le stress oxydatif cellulaire sur le stress de l’environnement, fournissant des indices pour les études mécanistes.

Introduction

Trois espèces réactives principales d’oxygène (ROS) produites par le métabolisme cellulaire qui sont de signification physiologique sont l’anion de superoxyde, le radical d’hydroxyle, et le peroxyde d’hydrogène^1. À de faibles concentrations, ils participent à des processus cellulaires physiologiques, mais à des concentrations élevées, ils ont des effets néfastes sur les voies de signalisation cellulaire¹. Notre corps a développé des systèmes antioxydants, qui sont efficaces contre le ROS excessif. Cependant, le stress oxydatif peut se produire lorsque ROS submerger la capacité détoxifiante de notre corps, ce qui contribu....

Protocol

1. Ensemencement cellulaire

1. Semences 2 x 10⁵ cellules cancéreuses colorectales HCT116 par puits dans une plaque de 24 puits et maintenir les cellules dans le milieu aigle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco pendant la nuit à 37 °C.
2. Remplacer le milieu de culture par ou sans sulfate ferreux (FS) ou 10 μM de doxorubicine (DOX) contenant un milieu et un incuber pendant 24 h.

2. Préparation de la solution DCFH-DA

1. Dissoudre 4,85 mg de DCFH-DA dans 1 mL de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) pour faire une solution de stock de 10 mM.
2. Diluer la solution de stock avec DMEM préchauffé en solution de ....

Results

Les cellules cancéreuses colorectales HCT116 ont été traitées avec 100 μM FS ou 10 μM DOX pour induire un stress oxydatif⁷. Comme le montre la figure 1, la fluorescence verte a été considérablement augmentée par FS et DOX comme prévu. Pour quantifier le changement relatif d’intensité, les cellules ont été lysées après prise d’images et normalisées avec des concentrations de protéines. L’intensité quantifiée de fluorescence a été significativement augmentée par FS ou D.......

Discussion

Le protocole expérimental décrit ici est facilement reproductible pour mesurer le total cellulaire ROS. Les étapes critiques incluent la fabrication de la solution DCFH-DA fraîche et l’évitement de l’exposition à la lumière, la minimisation des perturbations de l’état cellulaire et le lavage complet de PBS juste avant de prendre des images. Pour la préparation de la solution de travail DCFH-DA, la solution de stock doit être ajoutée dans DMEM préchauffé juste avant d’ajouter dans la plaque de puits 24. La raison en est q.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diacétate de 2',7'-dichlorofluorescéine	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Chlorhydrate de doxorubicine	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning, Corning, NY	45000-304
Sulfate ferreux heptahydraté	VWR, Radnor, PA	97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	ou tout autre microscope à fluorescence
Dosage des protéines Solution Bradford	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
SpectraMax M2 Lecteur de microplaques	Dispositifs moléculaires, Radnor, PA	89429-532	ou tout autre lecteur de microplaques à fluorescence