الكشف عن مجموع أنواع الأكسجين التفاعلي في الخلايا المنضمة من قبل 2'،7'-ديكلوروديدروفلوريسين Diacetate تلطيخ
Summary
هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن مجموع أنواع الأكسجين التفاعلي الخلوي (ROS) باستخدام 2’،7′-ديكلوروديدروفلوريسين diacetate (DCFH-DA). يمكن لهذه الطريقة تصور تعريب ROS الخلوي في الخلايا المُلزِمة مع مجهر الفلوريسنس وقياس شدة ROS مع قارئ لوحة الفلوريسين. وهذا البروتوكول بسيط وفعال وفعال من حيث التكلفة.
Abstract
الإجهاد التأاكسدي هو حدث مهم في ظل كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. في هذه الدراسة، ونحن نبين كيفية قياس الإجهاد التأكسي من خلال قياس مجموع أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) باستخدام 2’،7′-dichlorodihydrofluscein diacetcein (DCFH-DA) تلطيخ في خطوط الخلايا السرطانية القولونية كمثال. يصف هذا البروتوكول الخطوات التفصيلية بما في ذلك إعداد حل DCFH-DA، واحتضان الخلايا مع حل DCFH-DA، وقياس الكثافة الطبيعية. DCFH-DA تلطيخ هو وسيلة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن ROS في الخلايا. ويمكن استخدامه لقياس جيل ROS بعد العلاج الكيميائي أو التعديلات الجينية. ولذلك، فمن المفيد لتحديد الأكسدة الخلوية على الإجهاد البيئة، وتوفير أدلة على الدراسات الميكانيكية.
Introduction
ثلاثة أنواع الأكسجين التفاعلي الرئيسية (ROS) التي تنتجها الأيض الخلوية التي هي ذات معنى فسيولوجي هي أنيون أكسيد فائق، هيدروكسيل الراديكالية، و بيروكسيد الهيدروجين1. في تركيزات منخفضة، فإنها تشارك في عمليات الخلايا الفسيولوجية، ولكن في تركيزات عالية لديهم آثار سلبية على مسارات إشارة الخلية1. وقد طور الجسم أنظمة مضادة للأكسدة، والتي هي فعالة ضد الإفراط في ROS. ومع ذلك ، يمكن أن يحدث الإجهاد التأسدي عندما تطغى ROS على قدرة الجسم على إزالة السموم ، مما يساهم في العديد من الحالات المرضية ، بما في ذلك الالتهاب والسرطان والأمراض العصبيةالتنكسية 2،3،4. والغرض من هذه الطريقة هو تحديد مجموع الوردي الخلوي في الخلايا المتصونة باستخدام 2’،7′-ديكلوروديدروفلوريسين diacetate (DCFH-DA) تلطيخ. والأساس المنطقي هو أن أكسدة DCFH-DA إلى 2′-7’dichlorofluorescein (DCF) قد استخدمت على نطاق واسع للكشف عن مجموع ROS بما في ذلك الجذور الهيدروكسيل (•OH) وثاني أكسيد النيتروجين (• NO2). ميكانيكيا, يتم تناول DCFH-DA من قبل الخلايا حيث شقوق esterase الخلوية قبالة مجموعات أسيتيل, مما أدى إلى DCFH. أكسدة DCFH من قبل ROS يحول الجزيء إلى DCF، الذي ينبعث الفلوروس الأخضر في الطول الموجي الإثارة من 485 نانومتر و طول موجة الانبعاثات من 530 نانومتر. بالمقارنة مع الكشف عن الفلوريسين مع تدفق الأساليب البديلة وغيرها من الطرق البديلة5، مزايا هذا الأسلوب باستخدام المجهر الفلوريس وقارئ لوحة هي أنه ينتج صورا الفلورسنت مرئية بوضوح ، وسهلة الأداء وفعالة وفعالة من حيث التكلفة. وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع للكشف عن الوردي الخلوي لدراسة مختلف الشروط6,7,8. يستخدم هذا البروتوكول للكشف عن إجمالي ROS في الخلايا المُتصّنة. قد تحتاج هذه الطريقة للكشف عن ROS في الخلايا المعلقة بعض التعديلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول التجريبي الموصوف هنا هو استنساخ بسهولة لقياس مجموع الوردي الخلوية. وتشمل الخطوات الهامة جعل DCFH-DA حل جديدة وتجنب التعرض للضوء، والتقليل من اضطراب حالة الخلية وغسل برنامج تلفزيوني واسعة النطاق الحق قبل التقاط الصور. لإعداد حل العمل DCFH-DA، ينبغي إضافة حل الأسهم إلى DMEM مسبقة الدفء ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (K01DK114390)، وهي منحة باحث باحث من جمعية السرطان الأمريكية (RSG-050-01-NEC)، وهي منحة مشروع تجريبي بحثي من جامعة نيو مكسيكو برنامج الصحة البيئية التوقيع و Superfund (P42 ES025589)، وجائزة مشروع المشاريع التجريبية للموارد المشتركة وجائزة المشروع التجريبي لدعم برنامج البحوث من مركز السرطان الشامل لجمهورية الأمم المتحدة وMM (P30CA118100) ، وجائزة محقق جديد من صناديق البحوث الصحية المخصصة في كلية الطب بجامعة نيو مكسيكو.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
References
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J., Walker, J. M. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
