2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出
Summary
ここでは、2′,7′-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセインジアセテート(DCFH-DA)を用いて全細胞活性酸素種(ROS)を検出するプロトコルを提示する。この方法は、蛍光顕微鏡で接着細胞における細胞ROS局在を可視化し、蛍光プレートリーダーでROS強度を定量化することができる。このプロトコルは、シンプルで効率的で費用対効果が高いプロトコルです。
Abstract
酸化ストレスは、生理学的および病理学的条件下で重要な事象である。本研究では、2′,7’ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)を用いて全活性酸素種(ROS)を測定し、大腸癌細胞系で染色を行い、酸化ストレスを定量する方法を例に示す。このプロトコルはDCFH-DA溶液の調製、DCFH-DA溶液による細胞のインキュベーション、および正規化された強度の測定を含む詳細なステップを記述する。DCFH-DA染色は、細胞内のROSを検出するためのシンプルで費用対効果の高い方法です。これは、化学処理または遺伝子改変後のROS生成を測定するために使用することができる。そのため、環境ストレス時の細胞酸化ストレスを決定するのに有用であり、機械学的研究の手がかりを提供する。
Introduction
生理的意味を持つ細胞代謝によって産生される3つの主要な活性酸素種(ROS)は、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、及び過酸化水素1である。低濃度では、それらは生理学的細胞プロセスに関与するが、高濃度では細胞シグナル伝達経路1に悪影響を及ぼす。私たちの体は、過剰なROSに対して有効である抗酸化システムを開発しました。しかし、酸化ストレスは、炎症、癌、および神経変性疾患,,2、3、4を含む多くの病的状態に寄与する、ROSが私たちの体の解毒能力を圧倒2するときに発生する可能性があります。この方法の目的は、2′,7′-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセインジアセテート(DCFH-DA)染色を使用して、接着細胞における総細胞ROSを決定することです。その根拠は、DCFH-DAから2′-7’ジクロロフルオレセイン(DCF)への酸化が、ヒドロキシルラジカル(•OH)および二酸化窒素(•NO2)を含む総ROS検出のために広く使用されてきたということです。機械学的に、DCFH-DAは、細胞エステラーゼがアセチル基を切断する細胞によって取り込まれるため、DCFHが得られます。ROSによるDCFHの酸化は、分子をDCFに変換し、励起波長485nmで緑色蛍光を放出し、発光波長は530nmです。フローサイトメトリーと他の代替方法5で蛍光の検出と比較すると、この方法の利点は、蛍光顕微鏡とプレートリーダーを用いて、それが明確に目に見える蛍光画像を生成し、かつ、効率的かつ費用対効果が高く、実行が容易である。この方法は、様々,な条件6、7、87を研究6するための細胞ROSを検出するために広く使用されている。8このプロトコルは、接着細胞の総ROSを検出するために使用されます。この方法を使用して懸濁液細胞のROSを検出するには、いくつかの変更が必要な場合があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する実験プロトコルは、細胞総ROSを測定するために容易に再現可能である。重要なステップには、DCFH-DA溶液を新鮮にし、光暴露を回避し、細胞状態障害を最小限に抑え、画像を撮る直前に広範なPBS洗浄を行う必要があります。DCFH-DA作業ソリューションの調製のために、ストック溶液は24ウェルプレートに追加する前に、事前に温められたDMEMに追加する必要があります。その理由?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の一部は、米国癌学会(RSG-18-050-01-NEC)の研究奨学生助成金である国立衛生研究所(K01DK114390)によって支えられ、研究パイロットプロジェクト助成金を受け取りました。 ニューメキシコ大学環境衛生署名プログラムとスーパーファンド(P42 ES025589)、共有資源パイロットプロジェクト賞、UNM総合がんセンターの研究プログラム支援パイロットプロジェクト賞(P30CA118100)ニューメキシコ大学医学部の健康研究基金の新しい研究者賞を受賞。
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
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