2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출
Summary
여기서, 우리는 2′,7′-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 총 세포 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 형광 현미경으로 부착 된 세포에서 세포 ROS 국소화를 시각화하고 형광 판 판독기와 ROS 강도를 정량화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하고 효율적이며 비용 효율적입니다.
Abstract
산화 스트레스는 생리학적 및 병리학 적 조건 모두에서 중요한 사건이다. 본 연구에서는 대장암 세포주에서 염색하는 2′,7′-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 총 반응성 산소 종(ROS)을 측정하여 산화 스트레스를 정량화하는 방법을 보여 준다. 이 프로토콜은 DCFH-DA 솔루션 의 준비, DCFH-DA 용액을 가진 세포의 인큐베이션 및 정규화된 강도의 측정을 포함한 상세한 단계를 설명합니다. DCFH-DA 염색은 세포에서 ROS를 검출하는 간단하고 비용 효율적인 방법입니다. 그것은 화학 적 치료 또는 유전자 변형 후 ROS 생성을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서, 그것은 환경 스트레스에 세포 산화 스트레스를 결정에 유용, 기계학 연구에 단서를 제공.
Introduction
생리학적 의미의 세포 대사에 의해 생성되는 3개의 주요 반응성 산소 종(ROS)은 초산화수소 음이온, 하이드록실 라디칼 및 과산화수소1이다. 낮은 농도에서, 그들은 생리 세포 과정에 참여, 하지만 높은 농도에서 그들은 세포 신호 경로에부작용1. 우리 몸은 과도한 ROS에 효과적인 항산화 시스템을 개발했습니다. 그러나, 산화 스트레스는 ROS가 염증, 암 및 신경 퇴행성 질환2,,3,,4를포함한 많은 병리학 적 조건에 기여하는 우리 몸의 해독 능력을 압도 할 때 발생할 수 있습니다. 이 방법의 목적은 2′,7′-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 염색을 사용하여 부착된 세포에서 총 세포 ROS를 결정하는 것이다. 그 근거는 DCFH-DA에서 2′-7’dichlorofluorescein (DCF)의 산화가 하이드록실 라디칼 (•OH) 및 이산화질소 (•NO2)를포함한 총 ROS 검출을 위해 광범위하게 사용되었다는 것입니다. 기계적으로, DCFH-DA는 세포 esterase가 아세틸 군에서 갈라지는 세포에 의해 채택되어 DCFH의 결과로. ROS에 의한 DCFH의 산화는 분자를 DCF로 변환하여 485 nm의 내분 파장과 530 nm의 방출 파장에서 녹색 형광을 방출합니다. 유동 세포측정및 기타대체방법으로형광의 검출에 비해5,형광 현미경 및 플레이트 판독기를 이용한 이 방법의 장점은 명확하게 보이는 형광 영상을 생성하고, 효율적이고 비용 효율적이다. 이 방법은 다양한 조건을 연구하기 위한 셀룰러 ROS를 검출하는 데 널리 사용되어 왔다6,,7,,8. 이 프로토콜은 부착 된 세포에서 총 ROS를 검출하는 데 사용됩니다. 서스펜션 셀에서 ROS를 감지하려면 이 방법을 사용하면 약간의 수정이 필요할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 실험 프로토콜은 세포 총 ROS를 측정하기 쉽게 재현할 수 있습니다. 중요한 단계에는 DCFH-DA 솔루션을 신선하게 만들고 광 노출을 방지하고, 세포 상태 방해를 최소화하고 이미지를 촬영하기 직전에 광범위한 PBS 세척이 포함됩니다. DCFH-DA 작업 솔루션의 준비를 위해 재고 솔루션은 24 웰 플레이트에 추가하기 직전에 미리 따뜻해진 DMEM에 추가되어야 합니다. 그 이유는 높은 배경 형광 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국 암 학회 (RSG-18-050-01-NEC)의 연구 학자 보조금인 국립 보건 원 (K01DK14390)에 의해 부분적으로 지원되었으며, 연구 파일럿 프로젝트 보조금은 뉴멕시코 대학교 환경 건강 서명 프로그램 및 슈퍼펀드(P42 ES025589), 공유 자원 시범 프로젝트 상 및 UNM 종합 암 센터의 연구 프로그램 지원 파일럿 프로젝트 상(P30CA118100) 뉴멕시코 의과 대학의 전담 건강 연구 기금에서 새로운 조사자 상을 수상했습니다.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
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