Påvisning av total reaktive oksygenarter i tilhengerceller av 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Flekker

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å oppdage totale cellulære reaktive oksygenarter (ROS) ved hjelp av 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Denne metoden kan visualisere cellulær ROS lokalisering i tilhengerceller med et fluorescensmikroskop og kvantifisere ROS-intensitet med en fluorescensplateleser. Denne protokollen er enkel, effektiv og kostnadseffektiv.

Abstract

Oksidativt stress er en viktig hendelse under både fysiologiske og patologiske forhold. I denne studien viser vi hvordan man kvantifisere oksidativt stress ved å måle totale reaktive oksygenarter (ROS) ved hjelp av 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) farging i kolorektal kreftcellelinjer som et eksempel. Denne protokollen beskriver detaljerte trinn, inkludert utarbeidelse av DCFH-DA-løsning, inkubasjon av celler med DCFH-DA-løsning og måling av normalisert intensitet. DCFH-DA farging er en enkel og kostnadseffektiv måte å oppdage ROS i celler. Den kan brukes til å måle ROS generasjon etter kjemisk behandling eller genetiske modifikasjoner. Derfor er det nyttig for å bestemme cellulær oksidativt stress på miljøstress, og gir ledetråder til mekanistiske studier.

Introduction

Tre store reaktive oksygenarter (ROS) produsert av cellulær metabolisme som er av fysiologisk betydning er superoksidanion, hydroksylradikal og hydrogenperoksid¹. Ved lave konsentrasjoner deltar de i fysiologiske celleprosesser, men ved høye konsentrasjoner har de bivirkninger på cellesignaler¹. Kroppen vår har utviklet antioksidantsystemer, som er effektive mot overdreven ROS. Oksidativt stress kan imidlertid oppstå når ROS overvelder kroppens avgiftende evne, noe som bidrar til mange patologiske tilstander, inkludert betennelse, kreft og nevrodegenerativ sykdom^2,3,4. Formålet med denne metoden er å bestemme total cellulær ROS i tilhengerceller ved hjelp av 2′,7′-diklordiohydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) farging. Begrunnelsen er at oksidasjon av DCFH-DA til 2′-7’diklorofluorescein (DCF) har blitt brukt mye for total ROS-deteksjon, inkludert hydroksylradikaler (•OH) og nitrogendioksid (•NO₂). Mekanistisk, DCFH-DA er tatt opp av celler der cellulær esterase cleaves av acetyl grupper, noe som resulterer i DCFH. Oksidasjon av DCFH av ROS konverterer molekylet til DCF, som avgir grønn fluorescens ved en eksitasjon bølgelengde på 485 nm og en utslipp bølgelengde på 530 nm. Sammenlignet med påvisning av fluorescens med strømningscytometri og andre alternative metoder⁵, fordeler med denne metoden ved hjelp av et fluorescensmikroskop og en plateleser er at den produserer tydelig synlige fluorescerende bilder, og er enkle å utføre, effektive og kostnadseffektive. Denne metoden har blitt mye brukt til å oppdage cellulær ROS for å studere ulike forhold^6,7,8. Denne protokollen brukes til å oppdage total ROS i tilhengerceller. Ved hjelp av denne metoden for å oppdage ROS i suspensjon celler kan trenge noen modifikasjoner.

Protocol

1. Cellereding Frø 2 x 105 HCT116 kolorektal kreftceller per brønn i en 24-brønnplate og vedlikehold cellene i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) over natten ved 37 °C. Bytt kulturmediet med eller uten 100 μM jernsulfat (FS) eller 10 μM doksorubicin (DOX) som inneholder medium og inkuber i 24 timer. 2. Tilberedning av DCFH-DA-oppløsningen Oppløs 4,85 mg DCFH-DA i 1 ml dimetylsulfoksid (DMSO) for å lage en 10 mM lagerløsning. …

Representative Results

HCT116 kolorektal kreftceller ble behandlet med 100 μM FS eller 10 μM DOX for å indusere oksidativt stress7. Som vist i figur 1ble grønn fluorescens dramatisk økt med både FS og DOX som forventet. For å kvantifisere den relative intensitetsendringen ble cellene lysert etter å ha tatt bilder og normalisert med proteinkonsentrasjoner. Den kvantifiserte fluorescensintensiteten ble signifikant økt med FS- eller DOX i HCT116-celler. <p class="jove_content" fo:…

Discussion

Den eksperimentelle protokollen som er beskrevet her er lett reproduserbar for å måle cellulær total ROS. De kritiske trinnene inkluderer å gjøre DCFH-DA-løsningen frisk og unngå lyseksponering, minimere cellestatusforstyrrelser og omfattende PBS-vask rett før du tar bilder. For fremstilling av DCFH-DA arbeidsløsning, bør lagerløsningen legges til pre-oppvarmet DMEM rett før du legger inn i 24 brønnplaten. Årsaken er at gamle løsninger som genererer høy bakgrunnsfluorescens eller lyseksponering vil føre …

Materials

2',7'-Dichlorofluorescein diacetate	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	20656
Doxorubicin hydrochloride	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning, Corning, NY	45000-304
Ferrous Sulfate Heptahydrate	VWR, Radnor, PA	97061-542
Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	or any other fluorescence microscope
Protein assay Bradford solution	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
SpectraMax M2 Microplate Reader	Molecular Devices, Radnor, PA	89429-532	or any other fluorescence microplate reader