En ny verktygslåda för utvärdering av genfunktioner med villkorlig Cas9-stabilisering
Summary
Här beskriver vi ett genomredigeringsverktyg baserat på temporal och villkorlig stabilisering av klustrad regelbundet interspaced kort palindromisk upprepning- (CRISPR-) associerat protein 9 (Cas9) under den lilla molekylen, Shield-1. Metoden kan användas för odlade celler och djurmodeller.
Abstract
Den klustrade regelbundet interspaced korta palindromiska repeat- (CRISPR-) associerade protein 9 (CRISPR/Cas9) tekniken har blivit ett utbrett laboratorieverktyg för att införa exakta och riktade modifieringar i genomet. Dess enorma popularitet och snabba spridning tillskrivs dess enkla användning och noggrannhet jämfört med sina föregångare. Ändå har den konstituerande aktiveringen av systemet begränsade tillämpningar. I detta dokument beskriver vi en ny metod som möjliggör temporal kontroll av CRISPR / Cas9 aktivitet baserat på villkorlig stabilisering av Cas9 proteinet. Genom att fusing en konstruerad mutant av rapamycinbindande proteinet FKBP12 till Cas9 (DD-Cas9) möjliggör snabb nedbrytning av Cas9 som i sin tur kan stabiliseras genom närvaron av en FKBP12 syntetisk ligand (Shield-1). Till skillnad från andra inducerbara metoder kan detta system enkelt anpassas för att generera bi-cistronic-system för att samexpressa DD-Cas9 med en annan gen av intresse, utan villkorad reglering av den andra genen. Denna metod möjliggör generering av spårbara system samt parallell, oberoende manipulering av alleler riktade mot Cas9-kärnan. Plattformen för denna metod kan användas för systematisk identifiering och karakterisering av väsentliga gener och förhör av funktionella interaktioner av gener i in vitro- och in vivo-inställningar.
Introduction
CRISPR-Cas9 som står för “klustrad regelbundet interspaced kort palindromisk upprepa-associerad protein 9” upptäcktes först som en del av studier på bakteriell adaptiv immunitet1,2. Idag har CRISPR/Cas9 blivit det mest erkända verktyget för programmerbar genredigering och olika iterationer av systemet har utvecklats för att möjliggöra transkriptionella och epigenetiskamodulering 3. Denna teknik möjliggör den mycket exakta genetiska manipuleringen av nästan alla sekvenser av DNA4.
De väsentliga komponenterna i någon CRISPR-genredigering är en anpassningsbar guide RNA-sekvens och Cas9-kärnan5. RNA-guiden binder till den mål-kompletterande sekvensen i DNA, som styr Cas9-kärnan för att utföra en dubbelsträngsbrytning vid en specifik punkt igenomet 3,4. Den resulterande klyvningsplatsen repareras sedan genom icke-homolog end-joining (NHEJ) eller homology-riktad reparation (HDR), med följden införande av förändringar i den riktade DNA-sekvensen5.
CRISPR/ Cas9-baserad genredigering är lätt att använda, och relativt billig jämfört med tidigare genredigeringstekniker och det har visat sig vara både effektivt och robust i en multiplicitet av system2,4,5. Ändå innebär systemet vissa begränsningar. Det konstituerande uttrycket för Cas9 har ofta visat sig resultera i ett ökat antal off-targets och högcelltoxicitet 4,6,7,8. Dessutom tar cas9:s konstituerande inriktning av essentiella och cellöverlevnadsgener bort från dess förmåga att utföra vissa typer av funktionella studier såsom kinetiska studier av celldöd7.
Olika inducerbara eller villkorligt kontrollerade CRISPR-Cas9-verktyg har utvecklats för att ta itu meddessa problem 6, såsom Tet-ON och Tet-Off9; Platsspecifik rekombination10. Kemiskt inducerad närhet11. inteinberoendeskarvning 3; och 4-Hydroxytamoxifen östrogenreceptor (ER) baserade nukleära lokaliseringssystem12. I allmänhet erbjuder de flesta av dessa förfaranden (intein spliting och kemiskt inducerade närhetsdelningssystem) inte reversibel kontroll, presenterar ett mycket långsamt kinetiskt svar på läkemedelsbehandling (Tet-On/Off-system), eller är inte mottagliga för hög genomströmningsmanipulation6.
För att hantera dessa begränsningar utvecklade vi en ny verktygslåda som inte bara ger snabb och robust tidsstyrd genredigering utan också säkerställer spårbarhet, tunabilitet och mottaglighet för genmanipulation med hög genomströmning. Denna nya teknik kan användas i cellinjer, organoider och djurmodeller. Vårt system är baserat på en konstruerad domän, när den smälts till Cas9 inducerar den sin snabba nedbrytning. Det kan dock snabbt stabiliseras med en mycket selektiv, giftfri, cellpermeabel liten molekyl. Mer specifikt konstruerade vi den mänskliga FKBP12 mutanta “destabiliserande domänen” (DD) till Cas9, vilket markerar Cas9 för snabb och konstituerande nedbrytning via ubiquitin-proteasomsystemet när det uttrycks i däggdjursceller13. DD syntetisk ligand, Shield-1 kan stabilisera DD-konformation, vilket förhindrar nedbrytning av proteiner som smälts till DD (såsom Cas9) på ett mycket effektivt sätt och med ett snabbt kinetisktsvar 14,15. Observera att Shield-1 binder med tre storleksordningar hårdare till mutanten FKBP12 än till dess vilda motsvarighet14.
DD-Cas9/Shield-1-paret kan användas för att studera systematisk identifiering och karakterisering av väsentliga gener i odlade celler och djurmodeller som vi tidigare visade genom att villkorligt rikta in sig på CypD-genen, som spelar en viktig roll i metabolismen av mitokondrier; EGFR, en nyckelspelare i onkogen omvandling; och Tp53, en central gen i DNA-skaderespons. Förutom temporalt och villkorligt kontrollerad genredigering är en annan fördel med metoden att stabiliseringen av DD-Cas9 är oberoende av dess transkription. Denna funktion möjliggör samuttryck, under samma promotor, av spårbara markörer samt rekombiner, såsom östrogenreceptorberoende rekombinas, CREER. I detta arbete visar vi hur vår metod framgångsrikt kan användas in vitro, för att villkorligt rikta in sig på till exempel DNA-replikeringsgenen RPA3.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9-tekniken har revolutionerat förmågan att funktionellt förhöra genom2. Inaktivering av gener resulterar dock ofta i cellletalitet, funktionella underskott och utvecklingsdefekter, vilket begränsar nyttan av sådana metoder för att studera genfunktioner7. Dessutom kan konstituerande uttryck för Cas9 leda till toxicitet och generering av effekter utanför målet6. Olika metoder har utvecklats för att tidsbestyra CRISPR-Cas9-baserade …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar tidigare medlemmar i vårt laboratorium och forskare Serif Senturk för tidigare arbete. Vi tackar Danilo Segovia för att han kritiskt har läst detta manuskript. Denna studie var möjlig och stöddes av Swim Across America och National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center program.
Materials
| 100mM DTT | Thermosfisher | ||
| 10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
| 10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
| colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
| DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
| FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
| Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
| Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
| secondary antibodies | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
| SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
| α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |
References
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
- Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
- Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
- Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
- Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149 (2016).
- Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046 (2016).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569 (2017).
- Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
- Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
- Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
- Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
- Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370 (2017).
- McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113 (2011).
- Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
- Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
- Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
- Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
- Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
- Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297 (2012).
- Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
- Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269 (2012).
- Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293 (2016).
