Her beskriver vi et genomredigeringsverktøy basert på den tidsmessige og betingede stabiliseringen av klyngert regelmessig interspaced kort palindromisk repetisjon- (CRISPR-) assosiert protein 9 (Cas9) under det lille molekylet, Shield-1. Metoden kan brukes til dyrkede celler og dyremodeller.
Den klyngede regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjons- (CRISPR-) assosierte protein 9 (CRISPR / Cas9) -teknologien har blitt et utbredt laboratorieverktøy for å introdusere nøyaktige og målrettede modifikasjoner i genomet. Den enorme populariteten og den raske spredningen tilskrives enkel bruk og nøyaktighet sammenlignet med forgjengerne. Likevel har den konstituerende aktiveringen av systemet begrensede applikasjoner. I dette dokumentet beskriver vi en ny metode som tillater tidsmessig kontroll av CRISPR/Cas9-aktivitet basert på betinget stabilisering av Cas9-proteinet. Fusing en konstruert mutant av rapamycin-bindende protein FKBP12 til Cas9 (DD-Cas9) muliggjør rask nedbrytning av Cas9 som igjen kan stabiliseres ved tilstedeværelsen av en FKBP12 syntetisk ligand (Shield-1). I motsetning til andre inducible metoder, kan dette systemet enkelt tilpasses for å generere bi-cistronic systemer for å co-uttrykke DD-Cas9 med et annet gen av interesse, uten betinget regulering av det andre genet. Denne metoden muliggjør generering av sporbare systemer samt parallell, uavhengig manipulering av alleler målrettet av Cas9-kjernease. Plattformen til denne metoden kan brukes til systematisk identifisering og karakterisering av essensielle gener og forhør av funksjonelle interaksjoner av gener i in vitro- og in vivo-innstillinger.
CRISPR-Cas9 som står for“clustered regular interspaced short palindromic repeats-associated protein 9” ble først oppdaget som en del av studier på bakteriell adaptiv immunitet1,2. I dag har CRISPR/Cas9 blitt det mest anerkjente verktøyet for programmerbar genredigering, og forskjellige iterasjoner av systemet er utviklet for å tillate transkripsjons- og epigenetiske moduler3. Denne teknologien muliggjør den svært presise genetiske manipuleringen av nesten hvilken som helst sekvens av DNA4.
De viktigste komponentene i enhver CRISPR genredigering er en tilpassbar guide RNA-sekvens og Cas9-kjernen5. RNA-guiden binder seg til den mål-komplementære sekvensen i DNA-et, og leder Cas9-kjernen til å utføre en dobbeltstrengspause på et bestemt punkt i genomet3,4. Det resulterende spaltingsstedet repareres deretter ved ikke-homolog ende-sammenføyning (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR), med den påfølgende innføringen av endringer i den målrettede DNA-sekvensen5.
CRISPR/Cas9-basert genredigering er enkel å bruke, og relativt billig sammenlignet med tidligere genredigeringsteknikker, og det har vist seg å være både effektivt og robust i et mangfold av systemer2,4,5. Likevel presenterer systemet noen begrensninger. Det konstituerende uttrykket for Cas9 har ofte vist seg å resultere i et økt antall off-targets og høy celletoksisitet4,6,7,8. I tillegg tar den konstituerende målrettingen av essensielle og celleoverlevelsesgener av Cas9 bort fra sin evne til å utføre visse typer funksjonelle studier som kinetiske studier av celledød7.
Ulike inducible eller betinget kontrollerte CRISPR-Cas9-verktøy er utviklet for å løse disse problemene6, for eksempel Tet-ON og Tet-Off9; områdespesifikk rekombinasjon10; kjemisk indusert nærhet11; intein avhengig skjøting3; og 4-Hydroxytamoxifen østrogenreseptor (ER) baserte kjernefysiske lokaliseringssystemer12. Generelt tilbyr de fleste av disse prosedyrene (intein skjøting og kjemisk indusert nærhet splitt systemer) ikke reversibel kontroll, presentere en svært langsom kinetisk respons på narkotikabehandling (Tet-On / Off system), eller er ikke egnet til høy-gjennomstrømning manipulasjon6.
For å løse disse begrensningene utviklet vi et nytt verktøysett som ikke bare gir rask og robust temporalkontrollert genredigering, men som også sikrer sporbarhet, tunability og egnethet til genmanipulering med høy gjennomstrømning. Denne nye teknologien kan brukes i cellelinjer, organoider og dyremodeller. Systemet vårt er basert på et konstruert domene, når det smeltes sammen til Cas9, induserer det sin raske nedbrytning. Det kan imidlertid raskt stabiliseres med et svært selektivt, ikke-giftig, cellegjennomtrengelig lite molekyl. Mer spesifikt konstruerte vi det menneskelige FKBP12 mutant “destabiliserende domenet” (DD) til Cas9, og markerte Cas9 for rask og konstituerende nedbrytning via allestedsnærværende proteasomsystemet når det uttrykkes i pattedyrceller13. DD syntetisk ligand, Shield-1 kan stabilisere DD-konformasjon, og dermed forhindre nedbrytning av proteiner smeltet til DD (som Cas9) på en svært effektiv måte, og med en rask kinetisk respons14,15. Vær oppmerksom på at Shield-1 binder seg med tre størrelsesordener strammere til mutanten FKBP12 enn til den ville motparten14.
DD-Cas9/Shield-1-paret kan brukes til å studere systematisk identifisering og karakterisering av essensielle gener i dyrkede celler og dyremodeller som vi tidligere viste ved betinget målretting av CypD-genet, som spiller en viktig rolle i metabolismen av mitokondrier; EGFR, en nøkkelspiller i onkogen transformasjon; og Tp53, et sentralt gen i DNA-skaderespons. I tillegg til temporally og betinget kontrollert genredigering, er en annen fordel med metoden at stabiliseringen av DD-Cas9 er uavhengig av transkripsjonen. Denne funksjonen muliggjør samuttrykk, under samme promotor, av sporbare markører samt rekombinasjoner, for eksempel østrogenreseptoravhengig rekombininase, CREER. I dette arbeidet viser vi hvordan vår metode kan brukes in vitro, til betinget mål for eksempel DNA-replikasjonsgen, RPA3.
CRISPR/Cas9-teknologien har revolusjonert evnen til funksjonelt å forhøre genomer2. Inaktivering av gener resulterer imidlertid ofte i celledødelighet, funksjonelle underskudd og utviklingsfeil, noe som begrenser nytten av slike tilnærminger for å studere genfunksjoner7. I tillegg kan konstituerende uttrykk for Cas9 føre til toksisitet og generering av off-target effekter6. Ulike tilnærminger er utviklet for å kontrollere CRISPR-Cas9-baserte …
The authors have nothing to disclose.
Vi takker tidligere medlemmer av vårt laboratorium og forsker Serif Senturk for tidligere arbeid. Vi takker Danilo Segovia for at han kritisk leste dette manuskriptet. Denne studien var mulig og støttet av Swim Across America og National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center-programmet.
100mM DTT | Thermosfisher | ||
10X FastDigest buffer | Thermosfisher | B64 | |
10X T4 Ligation Buffer | NEB | M0202S | |
colorimetric BCA kit | Pierce | 23225 | |
DMEM, high glucose, glutaMax | Thermo Fisher | 10566024 | |
FastAP | Thermosfisher | EF0654 | |
FastDigest BsmBI | Thermosfisher | FD0454 | |
Flag [M2] mouse mAb | Sigma | F1804-50UG | |
Genomic DNA extraction kit | Macherey Nagel | 740952.1 | |
lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
oligonucleotides | Sigma Aldrich | ||
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
psPAX2 | Addgene | 12260 | |
QIAquick PCR & Gel Cleanup Kit | Qiagen | 28506 | |
secondary antibodies | LICOR | ||
Shield-1 | Cheminpharma | ||
Stbl3 competent bacterial cells | Thermofisher | C737303 | |
SURVEYOR Mutation Detection Kit | Transgenomic/IDT | ||
T4 PNK | NEB | M0201S | |
Taq DNA Polymerase | NEB | M0273S | |
α-tubulin [DM1A] mouse mAb | Millipore | CP06-100UG |