Denne protokol viser real-time registrering af fuld dosis-respons relationer for agonist-induceret GPCR aktivering fra en enkelt celle lag dyrket på en enkelt mikroelektrode ved hjælp af label-fri impedans målinger. Den nye doseringsordning øger gennemløb betydeligt uden tab i tidsløsning.
Label-fri impedans-baserede analyser er i stigende grad bruges til ikke-invasivt undersøgelse ligand-induceret GPCR aktivering i cellekultur eksperimenter. Tilgangen giver celleovervågning i realtid med en enhedsafhængig tidsopløsning ned til flere snese millisekunder, og den er meget automatiseret. Men når antallet af prøver bliver høje (f.eks. dosisresponsundersøgelser for forskellige ligander), kan omkostningerne for engangselektrodearrays samt den tilgængelige tidsopløsning for sekventielle brønd-by-well-optagelser blive begrænsende. Derfor præsenterer vi her en seriel agonist tilføjelse protokol, som har potentiale til at øge produktionen af label-fri GPCR assays. Ved hjælp af den serielle agonist tilføjelse protokol, en GPCR agonist er tilføjet sekventielle i stigende koncentrationer til en enkelt celle lag, mens løbende overvågning af prøvens impedans (agonist mode). Med denne serielle tilgang er det nu muligt at etablere en fuld dosisresponskurve for en GPCR-agonist fra blot et enkelt cellelag. Den seriel agonist tilføjelse protokol gælder for forskellige GPCR kobling typer, Gq Gi / 0 eller Gs og det er kompatibel med rekombinant og endogenudtryk niveauer af receptoren under undersøgelsen. Receptor blokering af GPCR antagonister kan vurderes samt (antagonist mode).
Denne rapport indeholder en detaljeret beskrivelse af en seriel tilføjelse protokol udviklet til kvantificering af ligand-induceret G protein-koblet receptor (GPCR) aktivering i tilhængere spirende dyrkede celler ved label-fri impedans målinger. G protein-koblede receptorer (GPCRs) er involveret i et væld af fysiologiske funktioner og sygdomme hos mennesker1. På grund af dette og deres gode tilgængelighed på celleoverfladen er GPCR’er et af de vigtigste narkotikamål. Denne vurdering afspejles i et anslået antal ~700 godkendte lægemidler rettet mod GPCR,svarende til en andel på ~35 % på alle markedsførte lægemidler2.
Udviklingen af nye lægemidler omfatter to centrale processer: i) identifikation og funktionel karakterisering af biologiske målmolekyler og ii) opdagelsen af nye blystoffer og deres udvikling i administrative lægemidler. I begge processer er der behov for effektive metoder til kvantitativt at evaluere lægemiddelmålinteraktioner og den efterfølgende biologiske downstream-respons. Forskellige stadier i den prækliniske lægemiddeludviklingsproces gør brug af forskellige analysemetoder lige fra biomolekylære interaktionsundersøgelser mellem lægemiddel- og mål, over funktionelle undersøgelser af celler i kultur, til forsøg med punktafgifter på organmateriale eller hele dyr. Både fysiologisk betydning og biologisk kompleksitet stige fra førstnævnte til sidstnævnte3. Selv om det er det overordnede mål at minimere dyreforsøg, farmakologiske undersøgelser ved hjælp af isolerede organer fra laboratoriedyr eller endda hele dyr anses for at være uundgåelige til omfattende karakterisere nye lægemiddelkandidater. Med hensyn til analytisk udlæsning giver organfarmakologiundersøgelser en distalt, integrativ “holistisk” funktionel respons af højeste fysiologiske relevans. En ulempe ved sådanne forsøg er , at de ikke er forenelige med høj gennemløbsscreening af tekniske såvel som etiske årsager og i vid udstrækning er blevet erstattet af undersøgelser baseret på in vitrocellekultur4.
Metoder til at kvantificere GPCR aktivering i cellekulturer omfatter forskellige etiket-baserede kemiske analyser, som specifikt påvise sekunder budbringere, fosforylering tilstand nedstrøms signalering proteiner, transskriptionelle aktivering via visse transskription faktorer eller ligand-induceret intracellulære receptor handel4,5. En ulempe ved sådanne etiketbaserede analyser er nødvendigheden af at mærke cellerne med potentielt skadelige farvestoffer eller radioaktive markører. Dette kræver ofte at køre analysen som en slutpunkt-bestemmelse for en eksponeringstid, der skal specificeres a priori. Brug af etiketbaserede endepunktsanalyser lider under denne meget begrænsede og forudindtagede timing af forsøget og risikoen for, at kemiske etiketter og sonder kan forstyrre den almindelige cellefysiologi – potentielt ubemærket af eksperimentatoren.
I de seneste år, label-fri analyser til overvågning GPCR aktivering er opstået, ligesom impedans-baserede teknikker eller optiske metoder, der anvender resonant waveguide riste5,6. Mærkning af cellerne er eksperimentelt ikke påkrævet med disse tilgange. Da disse fysiske udlæsninger opererer på lav amplitude signaler, sådanne metoder betragtes som ikke-invasive, de giver mulighed for kontinuerlig celleovervågning potentielt i realtid, og observationstiden er kun begrænset af cellekulturen ikke af udlæsningen. Svarende til udlæsninger fra hele organer, label-fri tilgange ofte rapport om holistiskcellereaktioner, langt nedstrøms for receptor aktivering, når integration langs hele signalnetværket fører til tidsafhængige, men snarere uspecifikke ændringer i celle morfologi eller masse omfordeling. Mens impedansbaserede analyser måler den dielektriske signatur af ændringer i celleform7,8, er målinger ved hjælp af resonantbølgeføringsriste følsomme over for ændringer i brydningsindeks ved cellesubstratgrænsefladen som følge af dynamisk masseomfordeling (DMR)9. Den integrativkarakter gør labelfri metoder ekstremt følsomme over for receptormedierede hændelser uanset typen(e) af G-protein (Gq, Gi/0, Gs,G12/13) eller β-arrestin involveret i receptorens signaleringkaskade 6 og velegnet til receptorens endogene ekspressionsniveauer.
I en standard label-fri impedans-baserede analyse cellerne er konsekvent dyrket i multi-well plader med coplanar guld-film elektroder deponeret på bunden af hver brønd10. Disse elektrode arrays er forbundet til en impedans analysator og celle reaktioner på en eksperimentel stimulus registreres fra individuelle brønde ved tidsløst impedans aflæsninger. I en typisk GPCR analyse en ligand er tilføjet i individuelt forskellige koncentrationer til hver enkelt brønd. De ligand-inducerede ændringer i impedanstidskurset analyseres derefter med hensyn til karakteristiske kurvefunktioner såsom maksimal signalændring, område under kurven, signalændring inden for et givet tidsinterval eller hældning af kurven på et bestemt tidspunkt for at kvantificere ligandens styrke og virkning11.
Omkostningerne ved elektrodearrays kan begrænse anvendelsen af denne teknik i høj gennemløbscreening (HTS) kampagner. Med et stigende antal prøver, der skal følges parallelt, stiger antallet af individuelle målinger desuden og reducerer dermed den tilgængelige tidsopløsning for hver brønd gradvist – selv for state of the art multichannel-optagelser. Under sådanne forhold kan hurtige og forbigående cellereaktioner slippe ud af målingen. Hertil kommer, at den konventionelle en brønd – en koncentration tilgang pålægger en betydelig tid og omkostningsfaktor på perfunderede organ-on-chip eller body-on-chip udvikling med hensyn til deres egnethed i ligand-GPCR interaktion analyse.
Derfor udviklede vi en trinvis doseringsprotokol, der gør det muligt at registrere fuld dosisresponskurver for ligand-induceret GPCR-aktivering i dyrkede cellemonolag ved løbende at overvåge impedansen for en enkelt brønd, mens den agonistiske koncentration øges trinvist. Den seriet agonist tilføjelse protokol øger gennemløb pr godt fra en koncentration til 10 eller flere koncentrationer, som vist på det nuværende eksempel på humane U-373 MG celler, som endogent udtrykke histamin 1 receptor (H1R). Metoden har således potentiale til at forbedre gennemløbet betydeligt i analyser af etiketfri dosisrespons, mens tidsopløsningen bevares på det instrumentale maksimum.
Denne protokol beskriver en metode til etiketfri impedansmålinger for at bestemme forholdet mellem dosis og respons for agonist-induceret GPCR-aktivering i fravær eller tilstedeværelse af specifikke antagonister for den samme receptor. Beviset for denne metode blev fremlagt i en nylig publikation12. Så vidt vi ved, er det den første undersøgelse, der beskriver etableringen af en fuld dosis-respons kurve af agonist-medieret GPCR aktivering ved hjælp af en enkelt celle lag in vitro. Tilgangen…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Barbara Goricnick og Nadja Hinterreiter for deres hjælp med celledyrkning og forberedelse af eksperimentelle løsninger. Forfatterne anerkender taknemmeligt økonomisk støtte fra Research Training Group 1910 “Medicinsk kemi selektivgpcr ligands” finansieret af Den Tyske Forskningsfond (DFG) under tilskudnummer 222125149. JAS er især taknemmelig for et stipendium ydet af den bayerske ligestilling program.
Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | ||
8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) | |
96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
Micropipette large (100 – 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
Micropipette large (20 – 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) |