Stepwise Dosing Protocol voor verhoogde doorvoer in label-vrije impedance-based GPCR-tests
Summary
Dit protocol toont real-time registratie van volledige dosis-respons relaties voor agonist-geïnduceerde GPCR activering van een eencellige laag geteeld op een enkele micro-elektrode met behulp van label-vrije impedantie metingen. De nieuwe dosing regeling verhoogt aanzienlijk doorvoer zonder verlies in de tijd resolutie.
Abstract
Label-vrije impedantie-gebaseerde testen worden steeds vaker gebruikt om niet-invasief bestuderen ligand-geïnduceerde GPCR activering in celcultuur experimenten. De aanpak biedt real-time celbewaking met een apparaatafhankelijke tijdsresolutie tot enkele tientallen milliseconden en is sterk geautomatiseerd. Wanneer de steekproefaantallen echter hoog worden (bijvoorbeeld dosisresponsstudies voor verschillende liganden), kunnen de kosten voor de beschikbare elektrodearrays en de beschikbare tijdsresolutie voor sequentiële well-by-well-opnames beperkend worden. Daarom presenteren we hier een seriële agonist toevoeging protocol dat het potentieel heeft om de output van label-vrije GPCR testen aanzienlijk te verhogen. Met behulp van de seriële agonist toevoeging protocol, een GPCR agonist wordt achtereenvolgens toegevoegd in toenemende concentraties tot een enkele cel laag, terwijl voortdurend toezicht op impedantie van het monster (agonist modus). Met deze seriële aanpak is het nu mogelijk om een volledige dosis-responscurve vast te stellen voor een GPCR-agonist uit slechts één enkele cellaag. Het seriële agonist toevoegingsprotocol is van toepassing op verschillende GPCR-koppelingstypen, Gq Gi/0 of Gs en is compatibel met recombinante en endogene expressieniveaus van de onderzochte receptor. Receptor blokkeren door GPCR antagonisten is ook te beoordelen (antagonist-modus).
Introduction
Dit rapport presenteert een gedetailleerde beschrijving van een seriële toevoeging protocol ontwikkeld voor de kwantificering van ligand-geïnduceerde G eiwit-gekoppelde receptor (GPCR) activering in aanhangende cellen door label-vrije impedantie metingen. G eiwitgekoppelde receptoren (GPCRs) zijn betrokken bij een veelheid van fysiologische functies en menselijke ziekten1. Vanwege deze en hun goede toegankelijkheid aan het celoppervlak, GPCRs zijn een van de belangrijkste drug doelen. Deze beoordeling wordt weerspiegeld in een geschat aantal ~ 700 goedgekeurde geneesmiddelen gericht op GPCRs, gelijk aan een ~ 35% aandeel op alle op de markt gebrachte drugs2.
De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen omvat twee centrale processen: i) de identificatie en functionele karakterisering van biologische doelmoleculen, en (ii) de ontdekking van nieuwe loodstoffen en hun ontwikkeling tot administrable drugs. In beide processen zijn efficiënte methoden nodig om interacties met drugsengerichtheid en de daaropvolgende biologische downstreamrespons kwantitatief te evalueren. Verschillende stadia van het preklinische geneesmiddelenontwikkelingsproces maken gebruik van verschillende analysemethoden, variërend van biomoleculaire interactiestudies tussen medicijn en doel, over functionele studies over cellen in de cultuur, tot experimenten op uitgesneden orgaanmateriaal of hele dieren. Beide fysiologische betekenis en biologische complexiteit nemen toe van de eerste naar de laatste3. Hoewel het het algemene doel is om dierproeven te minimaliseren, worden farmacologische studies met behulp van geïsoleerde organen van proefdieren of zelfs hele dieren onvermijdelijk geacht om nieuwe kandidaat-geneesmiddelen volledig te karakteriseren. In termen van analytische uitlezing, orgaan farmacologie studies bieden een distale, integratieve “holistische” functionele respons van de hoogste fysiologische relevantie. Een nadeel van dergelijke experimenten is dat zij om zowel technische als ethische redenen niet verenigbaar zijn met een hoge doorvoerscreening en grotendeels zijn vervangen door studies op basis van in vitro celcultuur4.
Methoden om gpcr-activering in celculturen te kwantificeren, omvatten verschillende op etiketten gebaseerde chemische tests, die specifiek tweede boodschappers detecteren, fosforylatietoestand van downstream-signaaleiwitten, transcriptieactivering via bepaalde transcriptiefactoren of ligand-geïnduceerde intracellulaire receptorhandel4,5. Een nadeel van dergelijke op etiketten gebaseerde tests is de noodzaak om de cellen te etiketteren met mogelijk schadelijke kleurstoffen of radioactieve markers. Dit vereist vaak het uitvoeren van de test als een eindpunt-bepaling voor een blootstelling stijd die moet worden opgegeven a priori. Met behulp van label-gebaseerde eindpunt testen lijdt aan deze zeer beperkte en bevooroordeelde timing van het experiment en het risico dat chemische etiketten en sondes kunnen interfereren met de reguliere celfysiologie – potentieel onopgemerkt door de experimentator.
In de afgelopen jaren zijn labelvrije tests voor het monitoren van GPCR-activatie naar voren gekomen, zoals impedantiegebaseerde technieken of optische methoden die resonante waveguide roosters toepassen5,6. Etikettering van de cellen is experimenteel niet nodig met deze benaderingen. Aangezien deze fysieke uitlezingen werken op lage amplitude signalen, dergelijke methoden worden beschouwd als niet-invasief, ze zorgen voor continue cel monitoring potentieel in real time en de observatie tijd wordt alleen beperkt door de celcultuur niet door de uitlezing. Vergelijkbaar met uitlezingen van hele organen, label-vrije benaderingen vaak verslag over holistische celreacties, ver stroomafwaarts van receptor activering wanneer de integratie langs het hele signaleringsnetwerk leidt tot tijd-afhankelijke, maar eerder onspecifieke veranderingen in celmorfologie of massa herverdeling. Overwegende dat op impedantie gebaseerde tests de diëlektrische signatuur van veranderingen in celvorm7,8meten , metingen met behulp van resonerende golfgeleidingsroosters gevoelig zijn voor veranderingen in de brekingsindex op de celsubstraatinterface als gevolg van dynamische massaherverdeling (DMR)9. Het integrerende karakter maakt labelvrije methoden uiterst gevoelig voor receptorgemedieerde gebeurtenissen, ongeacht het type(en) van G-eiwit (Gq, Gi/0, Gs, G12/13) of β-arrestine die betrokken zijn bij de signaleringcascade6 en goed geschikt voor eneexpressieniveaus van de receptor.
In een standaard label-vrije impedantie-gebaseerde test de cellen zijn adherently geteeld in multi-well platen met coplanar goud-film elektroden afgezet op de bodem van elke put10. Deze elektrodearrays zijn verbonden met een impedantieanalyzer en de celreacties op een experimentele stimulus worden geregistreerd vanuit individuele putten door door de tijd opgeloste impedantiemetingen. In een typische GPCR-test wordt een ligand toegevoegd in individueel verschillende concentraties aan elk individu goed. De ligand-geïnduceerde veranderingen in de impedantie tijdcursus worden vervolgens geanalyseerd met betrekking tot karakteristieke curvekenmerken zoals maximale signaalverandering, gebied onder de curve, signaalverandering binnen een bepaald tijdsinterval of helling van de curve op een bepaald tijdspunt, om de potentie en werkzaamheid van de ligand te kwantificeren11.
De kosten van de elektrodearrays kunnen de toepassing van deze techniek beperken in HTS-campagnes (high throughput screening). Bovendien neemt het aantal afzonderlijke metingen toe en vermindert daarmee geleidelijk de beschikbare tijdsresolutie voor elke put – zelfs voor state-of-the-art meerkanaalsopnamen. Onder dergelijke omstandigheden kunnen snelle en voorbijgaande celreacties aan de meting ontsnappen. Bovendien, de conventionele een goed – een concentratie benadering legt een aanzienlijke tijd en kostenfactor op perfused organ-on-chip of body-on-chip ontwikkelingen met betrekking tot hun geschiktheid in ligand-GPCR interactie analyse.
Om deze reden ontwikkelden we een stapsgewijs doseringsprotocol dat het registreren van volledige dosisresponscurven van ligand-geïnduceerde GPCR-activering in gekweekte celmonolagen mogelijk maakt door de impedantie van één enkele put continu te monitoren, terwijl de agonistconcentratie stapsgewijs wordt verhoogd. Het seriële agonist toevoegingsprotocol verhoogt de doorvoer per put aanzienlijk van één concentratie naar 10 of meer concentraties, zoals blijkt uit het huidige voorbeeld van menselijke U-373 MG-cellen, die de histamine 1-receptor (H1R) endoopeerig uitdrukken. Zo heeft de methode het potentieel om de doorvoer in labelvrije dosisresponsstudies aanzienlijk te verbeteren, terwijl de tijdsresolutie op het instrumentele maximum wordt gehandhaafd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode voor labelvrije impedantiemetingen om de dosisresponsrelatie van agonist-geïnduceerde GPCR-activering te bepalen bij afwezigheid of aanwezigheid van specifieke antagonisten voor dezelfde receptor. Het proof of concept van deze methode werd gepresenteerd in een recente publicatie12. Voor zover wij weten is het de eerste studie die de oprichting beschrijft van een volledige dosisresponscurve van agonist-gemedieerde GPCR-activering met behulp van een eencellige la…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Barbara Goricnick en Nadja Hinterreiter voor hun hulp bij het kweken van cellen en het voorbereiden van experimentele oplossingen. De auteurs erkennen dankbaar financiële steun van de Research Training Group 1910 “Medicinale chemie van selectieve GPCR ligands” gefinancierd door de Duitse Research Foundation (DFG) onder subsidienummer 222125149. JAS is vooral dankbaar voor een beurs toegekend door de Beierse Gender Equality Program.
Materials
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | ||
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) | |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 – 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 – 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) |
References
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
