레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용
Summary
세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.
Abstract
레지오넬라 뉴모필라의 도트/Icm 분비 시스템은 박테리아 극에서 국소화되고 표적 세포에 단백질 및 DNA 기판의 전달을 중재하는 복합형 IV 분비 시스템(T4SS) 나노머신으로, 일반적으로 직접 세포 간 접촉을 요구하는 과정이다. 우리는 최근에 극저온 전자 단층 촬영 (cryo-ET)에 의해 Dot /Icm 장치의 구조를 해결하고 세포질 복합체에 연결되는 세포 봉투 에 걸친 채널을 형성하는 것으로 나타났습니다. 견본의 토착 구조물, 살아있는 세포 및 극저온 ET에 있는 형광 현미경 검사법, 단백질의 초기 시각화및 그밖 점/Icm subunits에 상대하여 각 기계 분대의 stoichiometry 그리고 생산의 타이밍을 보존하는 2개의 상보적인 접근을 적용하십시오. 극성 포지셔닝에 대한 요구 사항을 조사하고 T4SS 기계 생물 발생과 관련된 동적 특징을 특성화하기 위해, 우리는 염색체에 그들의 기본 위치에서 도트 / Icm ATPase 유전자에 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 융합했다. 다음 방법은 살아있는 세포의 정량형 형광 현미경 검사법을 통합하고 저온-ET는 그대로 세균 세포에서 이러한 단백질의 편도적 국소화, 역학 및 구조를 정량화합니다. 레지오넬라 폐렴구균 T4SS를 연구하기 위한 이러한 접근법을 적용하는 것은 도트/Icm 시스템의 기능을 특성화하는 데 유용하며 T4SS 또는 다른 유형의 세균 분비 복합체를 활용하는 다양한 세균성 병원체를 연구하는 데 적합할 수 있다.
Introduction
레지오넬라 폐렴구균 (L. 폐렴구기),군단의 병인 에이전트’ 질병의, 민물 저수지에 살고, 여기서 박테리아는 감염 과 수생 자유 수영 원생 동물 내에서 복제하여 전파. L. 폐렴구균은 식수원에서 에어로졸화된 박테리아를 흡입할 때 인간에게 질병 발병을 일으킨다. 감염된 세포에서, 숙주 통로의 전복은 L. 뉴모필라가 상주하는 환액의 내분비 성 성숙을 지연시키고 세균 복제를 지원하는 세포 구획의 생물 발생을 촉진할 수 있게 합니다. 이 과정은 도트/Icm으로 알려진 특수 세균형 IVB 분비 시스템(T4BSS)과 감염 시토솔로 전이되는 300개 이상의 “이펙터” 단백질의 레퍼토리에 의해 구동되어 세포 기능의조작을용이하게 하기 위해1, 2,3,4,5. 기능성 도트/Icm 장치가 결여된 돌연변이체는 숙주 시토솔내로 이펙터를 전달하지 못하고, 세포내 복제에 결함이 있으며, 질병6,7의동물 모델에서 항법성이다.
많은 세균종은 감염 과정에 필요한 매우 복잡하고 역동적인 다성분 기계를 개발했습니다. 도트/Icm 시스템과 같은 다른 T4BSS는 콕시엘라 버네티와 리케티엘라 그릴리와같은 세균성 병원체의 세포내 복제에도 필수적입니다. T4BSS는 DNA 전달을 중재하고 이펙터 단백질의 제한된 레퍼토리를 전달할 수 있는 프로토타입 유형 IVA 시스템과 진화적으로 관련이 있지만, Dot/Icm 시스템은 거의 두 배에 달하는 기계 성분을 가지고 있으며 다양한 이펙터를 제공합니다. 아마도, 구성 요소의 수의 이 확장은 쉽게8,9새로운 이펙터를 수용하고 통합 하는 점 /Icm 장치를 가능하게했다.
우리는 최근에 극저온 전자 단층 촬영 (cryo-ET)을 사용하여 도트 / Icm 장치의 구조를 해결했으며 세포 종역학 복합체에 연결되는 세포 봉투 스패닝 채널을 형성하는 것으로 나타났습니다. 추가 분석은 세포질 ATPase DotO와의 상호 작용을 통해 L. 폐렴 구균 세포 극에서 도트 /Icm 시스템과 연관된 세포 토졸릭 ATPase DotB가 있음을 밝혔다. 우리는 DotB가 대부분의 세균성 세포에 있는 세포토솔릭 운동을 표시한다는 것을 것을을 발견했습니다, 이 ATPase가 동적 세포토실 인구에서 존재하고 또한 극성 점/Icm 복합체와 연관된다는 것을 나타내는. 또한 DotO는 내부 멤브레인 복합체와 관련된 DotO 이형제의 hexameric 어셈블리를 형성하고 DotB hexamer는이 세포질 복합체의 기지에 결합합니다. DotB-DotO 에너지 복합체의 조립은 T4SS(그림1)10을통해 기판의 전좌를 지시하는 세포질 채널을 생성한다.
이러한 최근의 발전에도 불구하고, Dot/Icm 시스템이 어떻게 기능하는지, 그리고 각 단백질이 어떻게 조립되어 활성 장치를 형성하는지에 대해서는 거의 알려져 없다8. Dot/Icm T4SS의 규제 회로를 밝히는 것은 호스트 병원체 상호 작용의 분자 메커니즘을 이해하는 데 기본적입니다. 따라서, 우리는 슈퍼 폴더 GFP (sfGFP)로 태그가 지정된 필수 L. 폐렴 구균 도트 / Icm 시스템 구성 요소를 감지하고 특성화하기 위해 라이브 세포 현미경 검사법 및 저온 ET를 사용하는 방법에 대해 논의합니다. 정량형 형광 현미경 을 사용하여 DotB의 극성 국소화는 야생 형 배경 또는 유형 IV 시스템이 삭제될 때 정의됩니다. 시간 경과 현미경 검사법은 도트 / Icm cytosolic ATPases 사이의 국소화 와 역학의 차이를 정량화하는 데 사용됩니다.
라이브 이미징 및 저온-ET와 같은 두 가지 상보적 접근법의 결합된 적용은 다른 체외 시스템에 비해 이점을 제공합니다. 두 방법 모두 손상되지 않은 세포에서 수행되고 T4BSS의 자연 환경을 보존하므로 샘플 준비 중에 기본 구조의 중단을 최소화합니다. 단백질의 과발현은 분비 장치의 stoichiometry를 손상시킬 수 있기 때문에, sfGFP 융합은 레지오넬라 염색체에 대한 모든 유린교환을 통해 반환되어 각 융합이 단일 카피로 인코딩되고 발현은 내인성 프로모터에 의해 구동된다. 염색체 로 인코딩 된 융합의 시각화는 정의 된 시점에서 발현되는 단백질의 정확한 수준을 정량화 할 수 있습니다. Cryo-ET는 또한 분비 시스템의 구조를 결정하는 많은 장점을 가지고 있습니다. 가장 주목할만한 장점은 cryo-ET 샘플이 박테리아 세포 아키텍처의 맥락에서 기본 복합체를 보존하는 냉동 그대로 의 세포로 구성되어 있다는 것입니다. 따라서, 저온-ET는 막 복합체를 추출하고 핵심 장치에서 말초 단백질을 제거하거나 전체 구조를 변형시킬 수 있는 생화학적 정제 접근법보다 바람직할 수 있다. 또한, sfGFP와 같은 부피가 큰 단백질로 관심 있는 단백질을 태깅하면 저온 ET에 의해 검출가능한 질량을 추가하고 저온-ET에 의해 얻어진 구조에 도트/Icm 장치의 상이한 소복합체를 매핑하는 데 도움을 줄 수 있다.
이 접근은 세균성 세포막에서 집합하는 다분자 복합체에 관하여 구조적인 정보를 밝히기 위한 강력한 공구입니다. 이러한 기술을 사용하여 해명된 구조의 해석은 현장에서 T4BSS 구성 요소가 작동하는 방식, 함수에 필요한 이유, 구성 요소가 더 복잡한 내에서 상호 작용하는 방법 및 이러한 기능을 이해하는 데 도움이 됩니다. 하위 어셈블리가 수행됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세균 성 분 비 시스템의 기능을 해명 하는 호스트 병원 체 상호 작용의 완전 한 이해에 열쇠. 분비 시스템은 이펙터 단백질을 숙주 세포에 주입할 수 있는 복잡한 기계이며, 경우에 따라 세균 복제를 지원하는 세포내 틈새 시장 설립을 촉진합니다. 위의 방법은 호흡기 세균성 병원체 레지오넬라 폐렴구균의 도트 /Icm 분비 시스템을 연구하기위한 중요한 새로운 도구를 제공, 그 병원성에 필수…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.C. 및 C.R.R.은 NIH(R37AI041699 및 R21AI130671)에 의해 지원되었습니다. D.P., B.H., 및 J.L은 건강의 국가 학회에 의해 지원되었습니다 (R01AI087946 및 R01GM107629).
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
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