تطبيق التصوير الخلوي المباشر والتصوير المقطعي بالتبريد الإلكترون لحل الميزات الزمنية للالفيلقية الهوائية Dot/Icm نظام إفراز
Summary
تصوير الخلايا البكتيرية هو نهج بيولوجيا الأنظمة الناشئة الذي يركز على تحديد العمليات الثابتة والديناميكية التي تملي وظيفة الآلات الجزيئية الكبيرة. هنا ، يتم استخدام التكامل بين التصوير الكمي للخلايا الحية والتصوير المقطعي بالإلكترونات الباردة لدراسة Legionella الرئوية من نوع IV بنية نظام الإفراز ووظائفه.
Abstract
نظام إفراز Dot/Icm من الفيلق الرئوي Legionella هو نظام إفراز من النوع الرابع (T4SS) جهاز نانوي معقد يُجتار في القطب البكتيري ويتوسط في تسليم ركائز البروتين والحمض النووي إلى الخلايا المستهدفة ، وهي عملية تتطلب بشكل عام الاتصال المباشر من خلية إلى خلية. لقد حللنا مؤخرًا بنية جهاز Dot /Icm بواسطة التصوير المقطعي بالإلكترونات (cryo-ET) وأظهرنا أنه يشكل قناة ممتدة للغلاف الخلوي تتصل بمجمع سيتوبلازمي. تطبيق نهجين متكاملين التي تحافظ على الهيكل الأصلي للعينة، المجهر الفلوري في الخلايا الحية والتبريد-ET، يسمح في الموقع تصور البروتينات واستيعاب قياس الخلايا وتوقيت إنتاج كل مكون آلة بالنسبة إلى غيرها من الوحدات الفرعية نقطة / Icm. للتحقيق في متطلبات تحديد المواقع القطبية وتوصيف الميزات الديناميكية المرتبطة بالتكوين الحيوي لآلة T4SS ، قمنا بدمج جين ترميز بروتين الفلورسنت الأخضر فوق المجلد إلى جينات Dot / Icm ATPase في مواقعها الأصلية على الكروموسوم. تدمج الطريقة التالية المجهر المجهري للفلورية الكمية للخلايا الحية والتبريد-ET لتحديد التوطين القطبي وديناميكيات وبنية هذه البروتينات في الخلايا البكتيرية السليمة. تطبيق هذه النهج لدراسة الفيلق ية الهوائية T4SS مفيد لتوصيف وظيفة نظام نقطة / Icm ويمكن تكييفها لدراسة مجموعة واسعة من مسببات الأمراض البكتيرية التي تستخدم T4SS أو أنواع أخرى من مجمعات إفراز البكتيريا.
Introduction
الفيلقية الرئوية (L. الرئوية),العامل المسببات لمرض الفيلق, يسكن خزانات المياه العذبة, حيث تنتشر البكتيريا عن طريق إصابة وتكرار داخل البروتوزوا المائية الحرة السباحة. L. الرئوي يسبب تفشي الأمراض في البشر عندما استنشاق البكتيريا الهباء الجوي من مصادر مياه الشرب يحدث. في الخلايا المصابة، تخريب مسارات المضيف يسمح L. الرئوي لتأخير النضج الانديسيمن اللافوال الذي يقيم فيه وتعزيز التكوين الحيوي للحجرة الخلوية التي تدعم النسخ البكتيري. والدافع وراء هذه العملية من قبل نوع البكتيريا المتخصصة IVB إفراز النظام (T4BSS) المعروفة باسم نقطة / Icm ذخيرتها من أكثر من 300 “المؤثرات” البروتينات التي يتم نقلها إلى السيتوسول المضيف أثناء العدوى لتسهيل التلاعب وظائف الخلوية1،2،3،4،5. المسوخ التي تفتقر إلى جهاز نقطة وظيفية / Icm تفشل في تقديم المؤثرات في السيتوسول المضيف ، معيبة للتكرار داخل الخلايا ، وهي في نماذج الحيوانات من المرض6،7.
وقد وضعت العديد من الأنواع البكتيرية آلات متعددة المكونات معقدة للغاية وديناميكية المطلوبة لعمليات العدوى. T4BSS أخرى مثل نظام نقطة / Icm ضرورية أيضا لتكرار داخل الخلايا من مسببات الأمراض البكتيرية مثل Coxiella burnetii وريكيتسيلا غريللي. على الرغم من أن T4BSS ترتبط تطورًا بأنظمة IVA من النوع النموذجي ، والتي تتوسط في نقل الحمض النووي ويمكن أن توفر ذخيرة محدودة من البروتينات المؤثرات ، فإن نظام Dot / Icm يحتوي على ضعف العديد من مكونات الجهاز ويسلم مجموعة واسعة من المؤثرات. ويفترض أن هذا التوسع في عدد من المكونات قد مكنت جهاز نقطة / Icm لاستيعاب ودمج المؤثرات الجديدة بسهولة8،9.
لقد استخدمنا مؤخرًا التصوير المقطعي بالإلكترونات (cryo-ET) لحل بنية جهاز Dot/Icm في الموقع وأظهرنا أنه يشكل قناة ممتدة للغلاف الخلوي تتصل بمجمع سيتوبلازمي. وكشف مزيد من التحليل أن CYTOsolic ATPase DotB المنتسبين مع نظام نقطة / Icm في القطب L. خلية الرئوية من خلال التفاعلات مع ATPase DotO الخلوي. لقد اكتشفنا أن DotB يعرض حركة دورية في معظم الخلايا البكتيرية ، مما يشير إلى أن هذا ATPase موجود في مجموعة دورية ديناميكية ولكنه يرتبط أيضًا بمجمعات Dot / Icm القطبية. بالإضافة إلى ذلك ، تشكل DotO تجميعًا حشسيًا من أجهزة الديمون DotO المرتبطة بمجمع الغشاء الداخلي ، وينضم سداسي DotB إلى قاعدة هذا المجمع السيتوبلازمي. تجميع مجمع الطاقة DotB-DotO يخلق قناة السيتوبلازمية التي توجه نقل الركائز من خلال T4SS(الشكل 1)10.
على الرغم من هذه التطورات الأخيرة ، لا يعرف سوى القليل عن كيفية وظائف نظام Dot / Icm وكيف يتجمع كل بروتين لتشكيل جهاز نشط8. الكشف عن الدوائر التنظيمية للنقطة / Icm T4SS أمر أساسي لفهم الآليات الجزيئية للتفاعلات المضيفة الممرض. لذلك ، نناقش كيفية استخدام المجهر الخلية الحية والتبريد ET للكشف عن وتوصيف الأساسية L. الرئوية دوت / Icm مكونات النظام التي يتم وضع علامة مع سوبر المجلد GFP (sfGFP). باستخدام المجهر الفلوري الكمي ، سيتم تعريف التعريب القطبي لـ DotB في خلفية من النوع البري أو عند حذف نظام النوع الرابع. سيتم استخدام المجهر الفاصل الزمني لقياس الاختلافات في التعريب والديناميكيات بين ATPases Cytosolic Dot/Icm.
التطبيق المشترك لنهجين متكاملين مثل التصوير الحي والتبريد ET يوفر ميزة بالمقارنة مع غيرها من الأنظمة المختبرية. يتم تنفيذ كلتا الطريقتين في خلايا سليمة والحفاظ على البيئة الطبيعية للT4BSS، وبالتالي تقليل اضطراب الهيكل الأصلي أثناء إعداد العينة. لأن الإفراط في التعبير عن البروتينات قد يضعف قياس التروية من جهاز إفراز، يتم إرجاع الاندماجsfGFP عن طريق تبادل أليليإلى كروموسوم الفيلقية بحيث يتم ترميز كل الانصهار في نسخة واحدة ويحرك التعبير من قبل المروج الذاتية. تصور الانصهار الكروموسومات المشفرة تمكن من القياس الكمي للمستوى الدقيق للبروتين الذي يتم التعبير عنه في نقطة زمنية محددة. Cryo-ET أيضا العديد من المزايا لتحديد هيكل أنظمة إفراز. الميزة الأبرز هي أن عينات Cryo-ET تتكون من خلايا مجمدة سليمة تحافظ على المجمعات الأصلية في سياق بنية الخلايا البكتيرية. وبالتالي، قد يكون من الأفضل للكبوو-ET نهج تنقية البيوكيميائية، التي تستخرج المجمعات الأغشية وقد تجرد البروتينات الطرفية من الجهاز الأساسي أو تعديل الهيكل العام. بالإضافة إلى ذلك ، وضع علامات على بروتين مهم مع بروتين ضخم مثل sfGFP يضيف كتلة يمكن اكتشافها بواسطة Cryo-ET ويمكن أن تساعد في رسم خرائط المجمعات الفرعية المختلفة لجهاز Dot / Icm على الهيكل الذي تم الحصول عليه بواسطة cryo-ET.
هذا النهج هو أداة قوية للكشف عن المعلومات الهيكلية حول المجمعات المتعددة الجزيئية التي تتجمع في غشاء الخلية البكتيرية. سيساعد تفسير الهياكل التي تم توضيحها باستخدام هذه التقنيات الحقل على فهم كيفية عمل مكونات T4BSS ، ولماذا هناك حاجة إلى العديد من المكونات للوظيفة ، وكيف تتفاعل المكونات داخل المجمع الأكبر ، وما هي وظائف هذه التجميعات الفرعية تنفيذ.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن توضيح وظائف أنظمة الإفراز البكتيري هو المفتاح لفهم كامل للتفاعلات بين المضيف والعامل الممرض. أنظمة الإفراز هي آلات معقدة يمكنها حقن البروتينات المؤثرات في الخلايا المضيفة ، وفي بعض الحالات تعزز إنشاء مكانة دون خلوية تدعم النسخ البكتيري. الأسلوب أعلاه يوفر أدوات جديدة هامة لدراسة نظام…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العاصمة وC.R.R. من قبل المعاهد القومية للصحة (R37AI041699 وR21AI130671). تم دعم D.P. و B.H. و J.L. من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01AI087946 وR01GM107629).
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
- Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).
- Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Isberg, R. R., O’Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
- Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
- Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires’ Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).
- Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
- Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
- Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
- Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
- Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).
- Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
- Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
- Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
- Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
- Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
- Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
