Anvendelse af Live Cell Imaging og Cryo-Electron Tomography at løse Spatiotemporal Funktioner i Legionella pneumophila Dot / Icm Sekresion System
Summary
Billeddannelse af bakterieceller er en ny systembiologitilgang, der fokuserer på at definere statiske og dynamiske processer, der dikterer funktionen af store makromolekylære maskiner. Her er integration af kvantitative levende celle imaging og kryo-elektron tomografi bruges til at studere Legionella pneumophila type IV sekresion system arkitektur og funktioner.
Abstract
Dot/Icm sekresionssystemet af Legionella pneumophila er et komplekst type IV sekredionssystem (T4SS) nanomaskine, der lokaliserer på bakteriestangen og formidler leveringen af protein og DNA-substrater til at målrette celler, en proces, der generelt kræver direkte celle-til-celle kontakt. Vi har for nylig løst strukturen af Dot / Icm apparat ved kryo-elektron tomografi (cryo-ET) og viste, at det danner en celle kuvert-spænder kanal, der forbinder til en cytoplasmatisk kompleks. Anvendelse af to komplementære tilgange, der bevarer den oprindelige struktur af prøven, fluorescerende mikroskopi i levende celler og cryo-ET, giver mulighed for in situ visualisering af proteiner og assimilering af stoichiometri og timing en produktion af hver maskine komponent i forhold til andre Dot / Icm underenheder. For at undersøge kravene til polar positionering og til at karakterisere dynamiske funktioner forbundet med T4SS maskine biogenese, har vi smeltet et gen kodning superfolder grøn fluorescerende protein til Dot / Icm ATPase gener på deres indfødte positioner på kromosomet. Følgende metode integrerer kvantitativ fluorescensmikroskopi af levende celler og kryo-ET for at kvantificere polarlokalisering, dynamik og struktur af disse proteiner i intakte bakterieceller. Anvendelse af disse tilgange til at studere Legionella pneumophila T4SS er nyttigt for at karakterisere funktionen af Dot / Icm systemet og kan tilpasses til at studere en bred vifte af bakterielle patogener, der udnytter T4SS eller andre typer af bakteriel sekresion komplekser.
Introduction
Legionella pneumophila (L. pneumophila), det ætiologiske agens af legionærsyge’ sygdom, lever ferskvandsreservoirer, hvor bakterierne formerer sig ved at inficere og replikere i akvatisk frisvømning protozoer. L. pneumophila forårsager sygdomsudbrud hos mennesker, når indånding af aerosoliserede bakterier fra drikkevandskilder forekommer. I inficerede celler, subversion af vært veje tillader L. pneumophila at forsinke endocytisk modning af vacuole, hvor det er bosat, og at fremme biogenese af en cellulær rum, der understøtter bakteriel replikation. Denne proces er drevet af en specialiseret bakteriel type IVB sekretion system (T4BSS) kendt som Dot / Icm og dens repertoire af over 300 “effektor” proteiner, der er omlagt til værten cytosol under infektion for at lette manipulation af cellulære funktioner1,2,3,4,5. Mutanter, der mangler et funktionelt Dot/Icm-apparat, leverer ikke effektorer ind i værtscytosolen, er defekte for intracellulær replikering og er avirulente i dyremodeller af sygdom6,7.
Mange bakteriearter har udviklet ekstremt komplekse og dynamiske multikomponentmaskiner, der er nødvendige for infektionsprocesser. Andre T4BSS som Dot / Icm systemet er også afgørende for intracellulære replikering af bakterielle patogener såsom Coxiella burnetii og Rickettsiella grylli. Selvom T4BSS er evolutionært relateret til prototypiske type IVA-systemer, som mægle DNA-overførsel og kan levere et begrænset repertoire af effektorproteiner, har Dot/Icm-systemet næsten dobbelt så mange maskinkomponenter og leverer en bred vifte af effektorer. Formentlig, denne udvidelse i antallet af komponenter har gjort det muligt for Dot / Icm apparat til at rumme og integrere nye effektorer let8,9.
Vi har for nylig brugt kryoelektron tomografi (kryo-ET) til at løse strukturen af Dot / Icm apparat in situ og viste, at det danner en celle kuvert-spænder kanal, der forbinder til en cytoplasmatisk kompleks. Yderligere analyse viste, at den cytosolic ATPase DotB forbinder med Dot / Icm systemet på L. pneumophila cellepol gennem interaktioner med den cytosolic ATPase DotO. Vi har opdaget, at DotB viser en cytosolic bevægelse i de fleste bakterieceller, hvilket indikerer, at denne ATPase er til stede i en dynamisk cytosolic befolkning, men også forbinder med polar Dot / Icm komplekser. Desuden danner DotO en hexameric samling af DotO dimers forbundet med den indre membran kompleks, og en DotB hexamer slutter sig til bunden af denne cytoplasmatiske kompleks. Samlingen af DotB-DotO-energikomplekset skaber en cytoplasmatisk kanal , der leder omplantningen af substrater gennem T4SS (Figur 1)10.
På trods af disse nylige fremskridt vides der ikke meget om, hvordan Dot/Icm-systemet fungerer, og hvordan hvert protein samles for at danne et aktivt apparat8. Afdækning af de lovgivningsmæssige kredsløb i Dot/Icm T4SS er afgørende for at forstå de molekylære mekanismer i værtspatogeninteraktioner. Derfor diskuterer vi, hvordan man bruger levende celle mikroskopi og kryo-ET til at opdage og karakterisere væsentlige L. pneumophila Dot / Icm systemkomponenter, der er mærket med super-mappe GFP (sfGFP). Ved hjælp af kvantitativ fluorescensmikroskopi defineres den polære lokalisering af DotB i en vild typebaggrund, eller når type IV-systemet slettes. Time-lapse mikroskopi vil blive brugt til at kvantificere forskelle i lokalisering og dynamik mellem Dot / Icm cytosolic ATPases.
Den kombinerede anvendelse af to komplementære tilgange såsom levende billeddannelse og kryo-ET giver en fordel i forhold til andre in vitro-systemer. Begge metoder udføres i intakte celler og bevarer det naturlige miljø i T4BSS, hvilket minimerer afbrydelse af den oprindelige struktur under prøveforberedelse. Da overekspression af proteiner kan forringe sekretreapparatets stoichiometri, returneres sfGFP-fusionerne via allelicudveksling til Legionella-kromosomet, så hver fusion kokodes i enkelt eksemplar, og udtrykket drives af den endogene promotor. Visualisering af kromosom-kodede fusioner gør det muligt at kvantificere det nøjagtige proteinniveau, der udtrykkes på et bestemt tidspunkt. Cryo-ET har også mange fordele ved at bestemme strukturen af sekresionsystemer. Den mest bemærkelsesværdige fordel er, at kryo-ET prøver består af frosne intakte celler, der bevarer indfødte komplekser i forbindelse med bakteriel celle arkitektur. Kryo-ET kan derfor være at foretrække frem for biokemiske rensningsmetoder, som udtrækker membrankomplekser og kan fjerne perifere proteiner fra kerneapparatet eller ændre den overordnede struktur. Hertil kommer, mærkning et protein af interesse med en voluminøs protein såsom sfGFP tilføjer en masse, der kan påvises ved cryo-ET og kan hjælpe med kortlægning af de forskellige subkomplekser af Dot / Icm apparat på strukturen opnået ved cryo-ET.
Denne tilgang er et kraftfuldt værktøj til at afdække strukturelle oplysninger om multimolekylære komplekser, der samles i bakteriecellemembranen. Fortolkningen af strukturer belyst ved hjælp af disse teknikker vil hjælpe området med at forstå, hvordan T4BSS-komponenter fungerer, hvorfor der kræves så mange komponenter til funktion, hvordan komponenterne interagerer inden for de større komplekse, og hvilke funktioner disse underenheder udføre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belysning af funktioner bakterielsekredionssystemer er nøglen til en fuldstændig forståelse af værts-patogen interaktioner. Sekretionssystemer er komplekse maskiner, der kan indsprøjte effektorer proteiner i værtsceller, og i nogle tilfælde fremme etableringen af en subcellulær niche, der understøtter bakteriel replikation. Ovenstående metode giver vigtige nye værktøjer til at studere Dot / Icm sekresion system af respiratoriske bakterielpatogenLegionella pneumophila, giver fingerpeg om mekanismerne …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.C. og C.R.R. blev støttet af NIH (R37AI041699 og R21AI130671). D.P., B.H., og J.L blev støttet af National Institutes of Health (R01AI087946 og R01GM107629).
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
- Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).
- Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Isberg, R. R., O’Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
- Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
- Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires’ Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).
- Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
- Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
- Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
- Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
- Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).
- Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
- Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
- Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
- Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
- Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
- Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
