Appliquer l’imagerie cellulaire en direct et la tomographie cryo-électronique pour résoudre les caractéristiques spatiotemporales du système de sécrétion Legionella pneumophila Dot/Icm

Résumé

L’imagerie des cellules bactériennes est une approche émergente de biologie des systèmes axée sur la définition de processus statiques et dynamiques qui dictent la fonction de grandes machines macromoléculaires. Ici, l’intégration de l’imagerie cellulaire vivante quantitative et de la tomographie cryo-électronique est utilisée pour étudier l’architecture et les fonctions du système de sécrétion de type IV de Legionella pneumophila.

Résumé

Le système de sécrétion Dot/Icm de Legionella pneumophila est une nanomachine complexe du système de sécrétion DE type IV (T4SS) qui localise au pôle bactérien et favorise la livraison de protéines et de substrats d’ADN aux cellules cibles, un processus nécessitant généralement un contact direct de cellule à cellule. Nous avons récemment résolu la structure de l’appareil Dot/Icm par la tomographie cryo-électronique (cryo-ET) et avons montré qu’il forme un canal de cellule qui s’étend sur une enveloppe cellulaire qui se connecte à un complexe cytoplasmique. L’application de deux approches complémentaires qui préservent la structure indigène du spécimen, la microscopie fluorescente dans les cellules vivantes et cryo-ET, permet la visualisation in situ des protéines et l’assimilation de la stoichiométrie et le moment de production de chaque composant de machine par rapport à d’autres sous-unités Dot/Icm. Pour étudier les exigences en matière de positionnement polaire et pour caractériser les caractéristiques dynamiques associées à la biogenèse de la machine T4SS, nous avons fusionné un gène codant des protéines fluorescentes vertes superpliantes aux gènes Dot/Icm ATPase à leurs positions indigènes sur le chromosome. La méthode suivante intègre la microscopie quantitative de fluorescence des cellules vivantes et cryo-ET pour quantifier la localisation polaire, la dynamique et la structure de ces protéines dans les cellules bactériennes intactes. L’application de ces approches pour étudier le Legionella pneumophila T4SS est utile pour caractériser la fonction du système Dot/Icm et peut être adaptée pour étudier une grande variété d’agents pathogènes bactériens qui utilisent le T4SS ou d’autres types de complexes de sécrétion bactérienne.

Introduction

Legionella pneumophila (L. pneumophila), l’agent éétiologique de la maladie des légionnaires, habite les réservoirs d’eau douce, où les bactéries se propagent en infectant et en se reproduisant dans les protozoaires aquatiques nageant librement. L. pneumophila provoque des éclosions de maladie chez l’homme lorsque l’inhalation de bactéries aérosolisées provenant de sources d’eau potable se produit. Dans les cellules infectées, la subversion des voies hôtes permet à L. pneumophila de retarder la maturation endocytique du vacuole dans lequel elle réside et de promouvoir la biogenèse d’un compartiment cellulaire qui soutient la réplica....

Protocole

REMARQUE : Toutes les procédures impliquant la croissance, la manipulation et l’imagerie de L. pneumophila doivent être effectuées dans un laboratoire biologique de niveau de sécurité 2 conformément aux directives locales.

1. Insertion de sfGFP dans le chromosome L. pneumophila à l’aide de la stratégie d’échange allégique et de sélection double (figure 2, figure 3)

1. Clonez dans le vecteur de remplacement génétique pSR47S¹¹ la séquence suivante : les 1 000 bp en amont du site d’intérêt, puis la séquence sfGFP, puis les 1 000 pb en a....

Résultats

La recombinaison homologue avec une double sélection en deux étapes a été utilisée pour construire l’insertion définie de sfGFP. Dans la première étape, l’accouplement triparental a été effectué, où le pRK600 plasmide conjugal (un plasmide IncP) de la souche d’aide E. coli MT616 a été mobilisé à la souche de donneur E. coli avec le vecteur suicide pSR47S contenant le gène SfGFP flanqué des deux régions homologues, l’origine du transfert oriT et le Bacillus subtilis contre-sacb. Ensuit.......

Discussion

L’élucidation des fonctions des systèmes de sécrétion bactérienne est la clé d’une compréhension complète des interactions hôte-pathogène. Les systèmes de sécrétion sont des machines complexes qui peuvent injecter des protéines effecteurs dans les cellules hôtes, et dans certains cas promouvoir l’établissement d’une niche subcellulaire qui soutient la réplication bactérienne. La méthode ci-dessus fournit de nouveaux outils importants pour étudier le système de sécrétion Dot/Icm de l’agent pathogène bactérien respiratoire.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Particules d’or colloïdal 10 nm	Aurion	25486
Objectif Plan Apo 100x (1.4 NA)	Nikon
ACES	Sigma-Aldrich	A9758
Charbon actif	Sigma-Aldrich	C5510
Agaroze GPG/LMP,	AB00981		bioanalytique américain
Gélose déshydratée Bacto	BD	214010
CoolSNAP EZ 20 MHz appareil photo numérique monochrome	Photométrie
Gene Frame, 1,7x2,8 cm, 125 & micro ; L	Fisher Scientific	AB-0578
Holey Grille carbone R 2/1 Cu 200 mesh	Quantifoil	Q225-CR1
Nitrate de fer(III) nonahydraté	Sigma-Aldrich	216828
K2 Caméra Summit pour cryo-EM	GATAN
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
Lames de couverture de microscope 22x22 mm	Fisher Scientific	12-542B
Lames de couverture de microscope 24x50 mm	Fisher Scientific	12-545K
Lames de microscope 25x75x1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Intelligent Imaging Innovations
Spectra X light engine	Lumencor
Taq 2X Master Mix	New England BioLabs	M0270
Titan Krios	Thermo Fisher
Scientific Extrait de levure	BD	212750

à bas point de fusion