Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System
Summary
Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.
Abstract
De Dot/Icm secretie systeem van Legionella pneumophila is een complex type IV secretie systeem (T4SS) nanomachine dat lokaliseert bij de bacteriële pool en bemiddelt de levering van eiwitten en DNA substraten om cellen te richten, een proces dat over het algemeen directe cel-naar-cel contact. We hebben onlangs de structuur van het Dot/Icm-apparaat opgelost door cryo-elektronentomografie (cryo-ET) en hebben aangetoond dat het een cel-overspannen kanaal vormt dat verbinding maakt met een cytoplasma-complex. Toepassing van twee complementaire benaderingen die de inheemse structuur van het monster te behouden, fluorescerende microscopie in levende cellen en cryo-ET, maakt in situ visualisatie van eiwitten en assimilatie van de stoichiometry en timing van de productie van elke machine component ten opzichte van andere Dot / Icm subeenheden. Om de vereisten voor polaire positionering te onderzoeken en dynamische kenmerken te karakteriseren die verband houden met T4SS-machinebiogenese, hebben we een gencoderingsupermap groen fluorescerend eiwit samengevoegd met Dot/Icm ATPase-genen op hun oorspronkelijke posities op het chromosoom. De volgende methode integreert kwantitatieve fluorescentiemicroscopie van levende cellen en cryo-ET om polaire lokalisatie, dynamiek en structuur van deze eiwitten in intacte bacteriële cellen te kwantificeren. Het toepassen van deze benaderingen voor het bestuderen van de Legionella pneumophila T4SS is nuttig voor het karakteriseren van de functie van het Dot/Icm-systeem en kan worden aangepast om een breed scala aan bacteriële pathogenen te bestuderen die gebruik maken van de T4SS of andere soorten bacteriële afscheidingscomplexen.
Introduction
Legionella pneumophila (L. pneumophila), de etiologische agent van legionairs ziekte, woont zoetwaterreservoirs, waar de bacteriën zich voortplanten door te infecteren en te repliceren in aquatische vrijzwemmen protozoa. L. pneumophila veroorzaakt ziekte-uitbraken bij de mens wanneer inademing van aerosolized bacteriën uit drinkbare waterbronnen optreedt. In geïnfecteerde cellen, subversie van gastheer trajecten kan L. pneumophila te vertragen endocytische rijping van de vacuole waarin het zich bevindt en biogenese van een cellulair compartiment dat bacteriële replicatie ondersteunt bevorderen. Dit proces wordt aangedreven door een gespecialiseerd bacterieel type IVB secretie systeem (T4BSS) bekend als Dot / Icm en het repertoire van meer dan 300 “effector” eiwitten die worden overgedragen in de gastheer cytosol tijdens infectie te vergemakkelijken manipulatie van cellulaire functies1,2,3,4,5. Mutanten die geen functioneel Dot/Icm-apparaat hebben, leveren geen effectoren in de gastheercytosol, zijn defect voor intracellulaire replicatie en zijn avirulent in diermodellen van ziekte6,7.
Veel bacteriële soorten hebben extreem complexe en dynamische multicomponent machines ontwikkeld die nodig zijn voor infectieprocessen. Andere T4BSS zoals de Dot / Icm systeem zijn ook essentieel voor intracellulaire replicatie van bacteriële pathogenen zoals Coxiella burnetii en Rickettsiella grylli. Hoewel T4BSS evolutionair verwant zijn aan prototypische IVA-systemen, die DNA-overdracht bemiddelen en een beperkt repertoire van effectoreiwitten kunnen leveren, heeft het Dot/Icm-systeem bijna twee keer zoveel machinecomponenten en levert het een breed scala aan effectoren. Vermoedelijk heeft deze uitbreiding van het aantal componenten het Dot/Icm-apparaat in staatgesteld om gemakkelijk8,9nieuwe effectoren op te vangen en te integreren.
We hebben onlangs cryo-elektronentomografie (cryo-ET) gebruikt om de structuur van het Dot/Icm-apparaat in situ op te lossen en toonden aan dat het een cel-overloopkanaal vormt dat verbinding maakt met een cytoplasma-complex. Verdere analyse toonde aan dat de cytosolic ATPase DotB associeert met het Dot/Icm systeem op de L. pneumophila celpool door middel van interacties met de cytosolic ATPase DotO. We hebben ontdekt dat DotB een cytosoieke beweging vertoont in de meeste bacteriële cellen, wat aangeeft dat deze ATPase aanwezig is in een dynamische cytosoieke populatie, maar ook associeert met de polaire Dot/Icm complexen. Daarnaast vormt DotO een hexameric assemblage van DotO dimers geassocieerd met het binnenste membraan complex, en een DotB hexamer sluit zich aan bij de basis van dit cytoplasmacomplex. De assemblage van het energiecomplex DotB-DotO creëert een cytoplasmathermisch kanaal dat de translocatie van substraten door de T4SS(figuur 1)10leidt.
Ondanks deze recente vooruitgang is er weinig bekend over hoe het Dot/Icm-systeem functioneert en hoe elk eiwit samenkomt om een actief apparaat te vormen8. Het blootleggen van de regelgevingscircuits van de Dot/Icm T4SS is van fundamenteel belang voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van host-pathogene interacties. Daarom bespreken we hoe we live celmicroscopie en cryo-ET kunnen gebruiken om essentiële L. pneumophila Dot/Icm-systeemcomponenten te detecteren en te karakteriseren die zijn gelabeld met supermap GFP (sfGFP). Met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie wordt de polarisatie van DotB gedefinieerd in een wilde achtergrond of wanneer het type IV-systeem wordt verwijderd. Time-lapse microscopie zal worden gebruikt om verschillen in lokalisatie en dynamiek tussen de Dot/Icm cytosolic ATPases te kwantificeren.
De gecombineerde toepassing van twee complementaire benaderingen zoals live imaging en cryo-ET biedt een voordeel ten opzichte van andere in vitro systemen. Beide methoden worden uitgevoerd in intacte cellen en behouden de natuurlijke omgeving van de T4BSS, waardoor verstoring van de oorspronkelijke structuur tijdens de voorbereiding van het monster wordt geminimaliseerd. Omdat overexpressie van eiwitten de stoichiometry van het secretieapparaat kan aantasten, worden sfGFP-fusies via allelic exchange teruggestuurd naar het Legionella-chromosoom, zodat elke fusie in één exemplaar wordt gecodeerd en de expressie wordt aangedreven door de endogene promotor. Visualisatie van chromosoomgecodeerde fusies maakt het mogelijk om het exacte eiwitgehalte op een bepaald tijdstip te kwantificeren. Cryo-ET heeft ook veel voordelen voor het bepalen van de structuur van secretiesystemen. Het meest opvallende voordeel is dat cryo-ET monsters bestaan uit bevroren intacte cellen die inheemse complexen behouden in de context van bacteriële celarchitectuur. Cryo-ET kan dus de voorkeur krijgen boven biochemische zuiveringsbenaderingen, die membraancomplexen extraheren en perifere eiwitten uit het kernapparaat kunnen halen of de algehele structuur kunnen wijzigen. Bovendien voegt het taggen van een eiwit met een omvangrijk eiwit zoals sfGFP een massa toe die door cryo-ET kan worden gedetecteerd en kan helpen bij het in kaart brengen van de verschillende subcomplexen van het Dot/Icm-apparaat op de structuur die door cryo-ET wordt verkregen.
Deze aanpak is een krachtig hulpmiddel voor het blootleggen van structurele informatie over multimoleculaire complexen die zich in het bacteriële celmembraan verzamelen. De interpretatie van structuren die met behulp van deze technieken worden toegelicht, zal het veld helpen begrijpen hoe T4BSS-componenten functioneren, waarom zoveel componenten nodig zijn voor functie, hoe de componenten interageren binnen het grotere complex en welke functies deze subassemblies presteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het verduidelijken van de functies van bacteriële afscheidingssystemen is de sleutel tot een volledig begrip van host-pathogene interacties. Secretiesystemen zijn complexe machines die effectoreneiwitten in gastheercellen kunnen injecteren en in sommige gevallen de oprichting van een subcellulaire niche bevorderen die bacteriële replicatie ondersteunt. De bovenstaande methode biedt belangrijke nieuwe instrumenten voor het bestuderen van de Dot / Icm afscheidingsysteem van de respiratoire bacteriële pathogene Legio…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.C. en C.R.R. werden ondersteund door de NIH (R37AI041699 en R21AI130671). D.P., B.H., en J.L. werden ondersteund door de National Institutes of Health (R01AI087946 en R01GM107629).
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
- Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).
- Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Isberg, R. R., O’Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
- Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
- Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires’ Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).
- Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
- Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
- Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
- Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
- Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).
- Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
- Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
- Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
- Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
- Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
- Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
