Appliquer l’imagerie cellulaire en direct et la tomographie cryo-électronique pour résoudre les caractéristiques spatiotemporales du système de sécrétion Legionella pneumophila Dot/Icm
Summary
L’imagerie des cellules bactériennes est une approche émergente de biologie des systèmes axée sur la définition de processus statiques et dynamiques qui dictent la fonction de grandes machines macromoléculaires. Ici, l’intégration de l’imagerie cellulaire vivante quantitative et de la tomographie cryo-électronique est utilisée pour étudier l’architecture et les fonctions du système de sécrétion de type IV de Legionella pneumophila.
Abstract
Le système de sécrétion Dot/Icm de Legionella pneumophila est une nanomachine complexe du système de sécrétion DE type IV (T4SS) qui localise au pôle bactérien et favorise la livraison de protéines et de substrats d’ADN aux cellules cibles, un processus nécessitant généralement un contact direct de cellule à cellule. Nous avons récemment résolu la structure de l’appareil Dot/Icm par la tomographie cryo-électronique (cryo-ET) et avons montré qu’il forme un canal de cellule qui s’étend sur une enveloppe cellulaire qui se connecte à un complexe cytoplasmique. L’application de deux approches complémentaires qui préservent la structure indigène du spécimen, la microscopie fluorescente dans les cellules vivantes et cryo-ET, permet la visualisation in situ des protéines et l’assimilation de la stoichiométrie et le moment de production de chaque composant de machine par rapport à d’autres sous-unités Dot/Icm. Pour étudier les exigences en matière de positionnement polaire et pour caractériser les caractéristiques dynamiques associées à la biogenèse de la machine T4SS, nous avons fusionné un gène codant des protéines fluorescentes vertes superpliantes aux gènes Dot/Icm ATPase à leurs positions indigènes sur le chromosome. La méthode suivante intègre la microscopie quantitative de fluorescence des cellules vivantes et cryo-ET pour quantifier la localisation polaire, la dynamique et la structure de ces protéines dans les cellules bactériennes intactes. L’application de ces approches pour étudier le Legionella pneumophila T4SS est utile pour caractériser la fonction du système Dot/Icm et peut être adaptée pour étudier une grande variété d’agents pathogènes bactériens qui utilisent le T4SS ou d’autres types de complexes de sécrétion bactérienne.
Introduction
Legionella pneumophila (L. pneumophila), l’agent éétiologique de la maladie des légionnaires, habite les réservoirs d’eau douce, où les bactéries se propagent en infectant et en se reproduisant dans les protozoaires aquatiques nageant librement. L. pneumophila provoque des éclosions de maladie chez l’homme lorsque l’inhalation de bactéries aérosolisées provenant de sources d’eau potable se produit. Dans les cellules infectées, la subversion des voies hôtes permet à L. pneumophila de retarder la maturation endocytique du vacuole dans lequel elle réside et de promouvoir la biogenèse d’un compartiment cellulaire qui soutient la réplication bactérienne. Ce processus est piloté par un système spécialisé de sécrétion de type bactérien IVB (T4BSS) connu sous le nom de Dot/Icm et son répertoire de plus de 300 protéines « effecteurs » qui sont translocalisés dans le cytosol hôte pendant l’infection pour faciliter la manipulation des fonctions cellulaires1,2,3,4,5. Les mutants dépourvus d’un appareil fonctionnel Dot/Icm ne parviennent pas à délivrer des effecteurs dans le cytosol hôte, sont défectueux pour la réplication intracellulaire, et sont avirulents dans les modèles animaux de la maladie6,7.
De nombreuses espèces bactériennes ont mis au point des machines multicomposantes extrêmement complexes et dynamiques qui sont nécessaires pour les processus d’infection. D’autres T4BSS comme le système Dot/Icm sont également essentiels pour la réplication intracellulaire d’agents pathogènes bactériens tels que Coxiella burnetii et Rickettsiella grylli. Bien que les T4BSS soient évolutivement liés aux systèmes IVA de type prototypique, qui servent de médiateur au transfert d’ADN et peuvent fournir un répertoire limité de protéines effectrices, le système Dot/Icm a presque deux fois plus de composants de machine et offre une grande variété d’effecteurs. Vraisemblablement, cette expansion du nombre de composants a permis à l’appareil Dot/Icm d’accueillir et d’intégrer facilement de nouveaux effecteurs8,9.
Nous avons récemment utilisé la tomographie cryo-électronique (cryo-ET) pour résoudre la structure de l’appareil Dot/Icm in situ et avons montré qu’il forme un canal de cellule qui s’étend sur une enveloppe cellulaire qui se connecte à un complexe cytoplasmique. Une analyse plus approfondie a révélé que le cytosolic ATPase DotB s’associe au système Dot/Icm au pôle cellulaire L. pneumophila par des interactions avec le cytosolic ATPase DotO. Nous avons découvert que DotB affiche un mouvement cytosolique dans la plupart des cellules bactériennes, ce qui indique que cet ATPase est présent dans une population cytosolique dynamique, mais s’associe également avec les complexes polar Dot/Icm. En outre, DotO forme un assemblage hexamerique de dimers DotO associés au complexe interne de membrane, et un hexamer DotB se joint à la base de ce complexe cytoplasmique. L’assemblage du complexe énergétique DotB-DotO crée un canal cytoplasmique qui dirige la translocation des substrats à travers le T4SS(figure 1)10.
Malgré ces progrès récents, on sait peu de choses sur le fonctionnement du système Dot/Icm et sur la façon dont chaque protéine s’assemble pour former un appareil actif8. La découverte des circuits réglementaires du T4SS Dot/Icm est fondamentale pour comprendre les mécanismes moléculaires des interactions hôte-pathogène. Par conséquent, nous discutons de la façon d’utiliser la microscopie cellulaire vivante et cryo-ET pour détecter et caractériser les composants essentiels du système L. pneumophila Dot/Icm qui sont étiquetés avec le super-folder GFP (sfGFP). À l’aide de la microscopie quantitative de fluorescence, la localisation polaire de DotB sera définie dans un fond de type sauvage ou lorsque le système de type IV est supprimé. La microscopie en accéléré sera utilisée pour quantifier les différences de localisation et de dynamique entre les ATPases cytosoliques Dot/Icm.
L’application combinée de deux approches complémentaires telles que l’imagerie en direct et le cryo-ET offre un avantage par rapport à d’autres systèmes in vitro. Les deux méthodes sont effectuées dans des cellules intactes et préservent l’environnement naturel du T4BSS, minimisant ainsi la perturbation de la structure indigène pendant la préparation de l’échantillon. Parce que la surexpression des protéines peut altérer la stoichiométrie de l’appareil de sécrétion, les fusions sfGFP sont retournées par échange allélique au chromosome Legionella de sorte que chaque fusion est codée en une seule copie et l’expression est conduite par le promoteur endogène. La visualisation des fusions codées chromosomalement permet de quantifier le niveau exact de protéines exprimés à un moment défini. Cryo-ET a également de nombreux avantages pour déterminer la structure des systèmes de sécrétion. L’avantage le plus notable est que les échantillons cryo-ET sont composés de cellules intactes congelées qui préservent les complexes indigènes dans le contexte de l’architecture des cellules bactériennes. Par conséquent, le cryo-ET peut être préférable aux approches de purification biochimique, qui extraient des complexes membranaires et peuvent dépouiller les protéines périphériques de l’appareil de base ou modifier la structure globale. En outre, le marquage d’une protéine d’intérêt avec une protéine encombrante comme le sfGFP ajoute une masse qui est détectable par cryo-ET et peut aider à cartographier les différents sous-modèles de l’appareil Dot/Icm sur la structure obtenue par cryo-ET.
Cette approche est un outil puissant pour découvrir des informations structurelles sur les complexes multimoléculaires qui s’assemblent dans la membrane cellulaire bactérienne. L’interprétation des structures élucidées à l’aide de ces techniques aidera le terrain à comprendre comment fonctionnent les composants T4BSS, pourquoi tant de composants sont nécessaires pour fonctionner, comment les composants interagissent dans le plus grand complexe, et quelles fonctions ces sous-assemblages effectuer.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’élucidation des fonctions des systèmes de sécrétion bactérienne est la clé d’une compréhension complète des interactions hôte-pathogène. Les systèmes de sécrétion sont des machines complexes qui peuvent injecter des protéines effecteurs dans les cellules hôtes, et dans certains cas promouvoir l’établissement d’une niche subcellulaire qui soutient la réplication bactérienne. La méthode ci-dessus fournit de nouveaux outils importants pour étudier le système de sécrétion Dot/Icm de l’agent…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.C. et C.R.R. ont été soutenus par les NIH (R37AI041699 et R21AI130671). D.P., B.H., et J.L. ont été soutenus par les National Institutes of Health (R01AI087946 et R01GM107629).
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
- Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).
- Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Isberg, R. R., O’Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
- Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
- Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires’ Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).
- Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
- Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
- Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
- Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
- Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).
- Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
- Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
- Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
- Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
- Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
- Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
