Bruke Live Cell Imaging og Cryo-Electron Tomography for å løse spatiotemporal funksjoner av Legionella pneumophila Dot / Icm Sekresjon System

Summary

Avbildning av bakterielle celler er en voksende systembiologi tilnærming fokusert på å definere statiske og dynamiske prosesser som dikterer funksjonen til store makromolekylære maskiner. Her brukes integrering av kvantitativ levende celleavbildning og kryoelektrontomografi til å studere Legionella pneumophila type IV sekresjonssystemarkitektur og funksjoner.

Abstract

Dot / Icm sekresjonssystemet legionella pneumophila er en kompleks type IV sekresjonssystem (T4SS) nanomaskin som lokaliserer på bakteriepolen og medierer levering av protein- og DNA-substrater for å målrette celler, en prosess som vanligvis krever direkte celle-til-celle-kontakt. Vi har nylig løst strukturen til Dot / Icm-apparatet ved kryoelektrontomografi (cryo-ET) og viste at den danner en cellekonvoluttskkende kanal som kobles til et cytoplasmatisk kompleks. Bruk av to komplementære tilnærminger som bevarer den opprinnelige strukturen i prøven, fluorescerende mikroskopi i levende celler og cryo-ET, tillater in situ visualisering av proteiner og assimilering av stoichiometry og tidspunktet for produksjonen av hver maskinkomponent i forhold til andre Dot / Icm underenheter. For å undersøke kravene til polar posisjonering og karakterisere dynamiske funksjoner forbundet med T4SS-maskinbiogenese, har vi smeltet sammen et genkoding av supermappe grønt fluorescerende protein til Dot/Icm ATPase-gener i sine opprinnelige posisjoner på kromosomet. Følgende metode integrerer kvantitativ fluorescensmikroskopi av levende celler og cryo-ET for å kvantifisere polar lokalisering, dynamikk og struktur av disse proteinene i intakte bakterielle celler. Bruk av disse tilnærmingene for å studere Legionella pneumophila T4SS er nyttig for å karakterisere funksjonen til Dot / Icm-systemet og kan tilpasses for å studere et bredt utvalg av bakterielle patogener som bruker T4SS eller andre typer bakteriellsekresjonskomplekser.

Introduction

Legionella pneumophila (L. pneumophila), etiologisk middel for Legionærsykdom, bor i ferskvannsreservoarer, hvor bakteriene forplanter seg ved å infisere og replikere i akvatiske frittsvømmende protozoer. L. pneumofila forårsaker sykdomsutbrudd hos mennesker når innånding av aerosoliserte bakterier fra drikkevannskilder oppstår. I infiserte celler gjør undergraving av vertsveier L. pneumofila å forsinke endocytisk modning av vacuole der den befinner seg og for å fremme biogenesis av et cellulært rom som støtter bakteriell replikering. Denne prosessen er drevet av en spesialisert bakteriell type IVB sekresjon system (T4BSS) kjent som Dot / Icm og dens repertoar av over 300 “effector” proteiner som er translocated til verten cytosol under infeksjon for å lette manipulering av cellulære funksjoner^1,2,3,4,5. Mutanter som mangler et funksjonelt Dot / Icm-apparat ikke klarer å levere effektorer inn i vertencytosol, er defekte for intracellulær replikering, og er avirulent i dyremodeller av sykdom^6,7.

Mange bakterielle arter har utviklet ekstremt komplekse og dynamiske multikomponentmaskiner som kreves for infeksjonsprosesser. Andre T4BSS som Dot / Icm systemet er også avgjørende for intracellulær replikering av bakterielle patogener som Coxiella burnetii og Rickettsiella grylli. Selv om T4BSS er evolusjonært relatert til prototypiske type IVA-systemer, som medierer DNA-overføring og kan levere et begrenset repertoar av effektorproteiner, har Dot / Icm-systemet nesten dobbelt så mange maskinkomponenter og leverer et bredt utvalg av effektorer. Formodentlig har denne utvidelsen i antall komponenter gjort det mulig for Dot/Icm-apparatet å imøtekomme og integrere nye effektorer enkelt^8,9.

Vi brukte nylig kryoelektrontomografi (cryo-ET) for å løse strukturen til Dot/Icm-apparatet in situ og viste at den danner en cellekonvoluttskkende kanal som kobles til et cytoplasmatisk kompleks. Videre analyse viste at den cytosolic ATPase DotB forbinder med Dot / Icm systemet på L. pneumophila cellepol gjennom interaksjoner med cytosolic ATPase DotO. Vi har oppdaget at DotB viser en cytosolic bevegelse i de fleste bakterielle celler, noe som indikerer at denne ATPase er til stede i en dynamisk cytosolic populasjon, men også forbinder med polardot / Icm komplekser. I tillegg danner DotO en hexameric montering av DotO-dimers forbundet med det indre membrankomplekset, og en DotB-hexamer slutter seg til bunnen av dette cytoplasmatiske komplekset. Monteringen av DotB-DotO energikompleks skaper en cytoplasmatisk kanal som styrer translokasjonen av underlag gjennom T4SS (Figur 1)¹⁰.

Til tross for disse siste fremskrittene, er lite kjent om hvordan Dot / Icm-systemet fungerer og hvordan hvert protein monteres for å danne et aktivt apparat⁸. Avdekke regulatoriske kretser av Dot / Icm T4SS er grunnleggende for å forstå de molekylære mekanismene for vertspatogen interaksjoner. Derfor diskuterer vi hvordan du bruker levende cellemikroskopi og cryo-ET for å oppdage og karakterisere essensielle L. pneumophila Dot / Icm systemkomponenter som er merket med super-mappe GFP (sfGFP). Ved hjelp av kvantitativ fluorescensmikroskopi vil polarlokaliseringen av DotB defineres i en vill typebakgrunn eller når type IV-systemet slettes. Tidsforløpmikroskopi vil bli brukt til å kvantifisere forskjeller i lokalisering og dynamikk mellom Dot / Icm cytosolic ATPases.

Den kombinerte anvendelsen av to komplementære tilnærminger som live imaging og cryo-ET gir en fordel i forhold til andre in vitro systemer. Begge metodene utføres i intakte celler og bevare det naturlige miljøet i T4BSS, og dermed minimere avbrudd av den opprinnelige strukturen under prøveforberedelse. Fordi overuttrykk av proteiner kan svekke stoichiometry av sekresjonsapparatet, returneres sfGFP-fusjoner via allelisk utveksling til Legionella-kromosomet slik at hver fusjon er kodet i enkelt kopi og uttrykket drives av den endogene arrangøren. Visualisering av kromosomalt kodet fusjoner gjør det mulig å kvantifisere det nøyaktige proteinnivået som uttrykkes på et definert tidspunkt. Cryo-ET har også mange fordeler for å bestemme strukturen av sekresjonssystemer. Den mest bemerkelsesverdige fordelen er at kryo-ET prøver består av frosne intakte celler som bevarer innfødte komplekser i sammenheng med bakteriell cellearkitektur. Derfor kan cryo-ET være å foretrekke fremfor biokjemiske rensemetoder, som trekker ut membrankomplekser og kan fjerne perifere proteiner fra kjerneapparatet eller endre den generelle strukturen. I tillegg, tagging et protein av interesse med en klumpete protein som sfGFP legger en masse som er påviselig av cryo-ET og kan bistå med å kartlegge de ulike subkomplekser av Dot / Icm apparatet på strukturen oppnådd av cryo-ET.

Denne tilnærmingen er et kraftig verktøy for å avdekke strukturell informasjon om multimolekylære komplekser som monteres i bakteriecellemembranen. Tolkningen av strukturer som er belyst ved hjelp av disse teknikkene, vil hjelpe feltet med å forstå hvordan T4BSS-komponenter fungerer, hvorfor så mange komponenter er nødvendige for funksjon, hvordan komponentene samhandler innenfor det større komplekse, og hvilke funksjoner disse subassemblies utføre.

Protocol

MERK: Alle prosedyrer som involverer vekst, manipulering og bildebehandling av L. pneumofila bør utføres i et biologisk sikkerhetsnivå 2-laboratorium i samsvar med lokale retningslinjer. 1. Innsetting av sfGFP i L. pneumophila kromosom ved hjelp av allelic Exchange og Double Selection Strategy (Figur 2, Figur 3) Klone inn i generstatningsvektoren pSR47S11 følgende sekvens: 1000 b…

Representative Results

Homolog rekombinasjon med dobbeltvalg i to trinn ble brukt til å konstruere den definerte innsettingen av sfGFP. I det første trinnet ble triparental parring utført, hvor pRK600 konjugativ plasmid (en IncP plasmid) fra E. coli helper stamme MT616 ble mobilisert til donor E. coli belastning med selvmordvektor pSR47S som inneholder sfGFP genet flankert av de to homologe regioner, opprinnelsen til overføring oriT og Bacillus til subis counterselection gene sacB. Deretter konjugeringss…

Discussion

Å belyse funksjonene til bakterielle sekresjonssystemer er nøkkelen til en fullstendig forståelse av vertspatogeninteraksjoner. Sekresjonssystemer er komplekse maskiner som kan injisere effektorer proteiner i vertsceller, og i noen tilfeller fremme etablering av en subcellulær nisje som støtter bakteriell replikering. Ovennevnte metode gir viktige nye verktøy for å studere Dot / Icm sekresjonssystemet til luftveisbakteriell patogen Legionella pneumophila, noe som gir ledetråder til mekanismene for effekt…

Materials

10 nm colloidal gold particles	Aurion	25486
100x Plan Apo objective (1.4 NA)	Nikon
ACES	Sigma-Aldrich	A9758
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	C5510
Agaroze GPG/LMP, low melt	American bioanalytical	AB00981
Bacto dehydrated agar	BD	214010
CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera	Photometrics
Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL	Fisher Scientific	AB-0578
Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh	Quantifoil	Q225-CR1
Iron(III) nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	216828
K2 Summit camera for cryo-EM	GATAN
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
Microscope cover slides 22×22 mm	Fisher Scientific	12-542B
Microscope cover slides 24×50 mm	Fisher Scientific	12-545K
Microscope slides 25x75x1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Intelligent Imaging Innovations
Spectra X light engine	Lumencor
Taq 2X Master Mix	New England BioLabs	M0270
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific
Yeast Extract	BD	212750