Применение Live Cell Imaging и крио-электронной томографии для устранения пространственно-временной особенностей системы Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion
Summary
Изображение бактериальных клеток является новым подходом биологии систем, ориентированных на определение статических и динамических процессов, которые диктуют функцию крупных макромолекулярных машин. Здесь для изучения архитектуры и функций системы секреции системы секреции legionella pneumophila IV типа используется интеграция количественной визуализации живых клеток и криоэлектронной томографии.
Abstract
Система секреции Dot/Icm пневмофилы Legionella является сложной системой секреции IV типа (T4SS), которая локализует на бактериальном полюсе и опосредует доставку белков и субстратов ДНК в клетки-мишени, процесс, обычно требующий прямого контакта между клетками и клетками. Недавно мы решили структуру аппарата Dot/Icm с помощью криоэлектронной томографии (крио-ET) и показали, что он образует клеточный конвертографический канал, который соединяется с цитоплазмическим комплексом. Применение двух взаимодополняющих подходов, сохраняющих родную структуру образца, флуоресцентную микроскопию в живых клетках и крио-ET, позволяет на месте визуализировать белки и усвоение стоихиометрии и сроки производства каждого компонента машины по сравнению с другими подразделениями Dot/Icm. Для изучения требований к полярному позиционированию и характеристики динамических особенностей, связанных с биогенезом машины T4SS, мы сплавили ген, кодируя суперфолдер зеленый флуоресцентный белок, к генам Dot/Icm ATPase на их родных позициях на хромосоме. Следующий метод интегрирует количественную флуоресценцию микроскопии живых клеток и крио-ET для количественной оценки полярной локализации, динамики и структуры этих белков в нетронутых бактериальных клетках. Применение этих подходов для изучения Legionella пневмофилы T4SS полезно для характеристики функции Dot / Icm системы и могут быть адаптированы для изучения широкого спектра бактериальных патогенов, которые используют T4SS или других типов бактериальных комплексов секреции.
Introduction
Легионелла пневмофила (L. pneumophila), этиологическое вещество болезни легионеров, обитает пресноводных резервуаров, где бактерии размножаются путем заражения и репликации в водной свободного плавания простейшие. L. пневмофила вызывает вспышки болезней у людей при вдыхании аэрозольных бактерий из источников питьевой воды. В инфицированных клетках, подрыв путей хозяина позволяет L. пневмофила отложить эндоцитарное созревание вакуол, в котором он проживает и содействовать биогенеза клеточного отсека, который поддерживает бактериальную репликацию. Этот процесс обусловлен специализированной бактериальной системой секреции IVB (T4BSS), известной как Dot/Icm, и его репертуар из более чем 300 “эффекторов” белков, которые трансвируются в цитозол хозяина во время инфекции для облегчения манипуляции клеточными функциями1,2,3,4,5. Мутанты, не имеющие функционального аппарата Dot/Icm, не могут доставить эффекторов в цитозол хозяина, неполноценны для внутриклеточной репликации и являются avirulent в животных моделях болезни6,7.
Многие бактериальные виды разработали чрезвычайно сложные и динамические многокомпонентные машины, которые необходимы для инфекционных процессов. Другие T4BSS, как Dot / Icm системы также имеют важное значение для внутриклеточной репликации бактериальных патогенов, таких как Coxiella burnetii и Rickettsiella grylli. Хотя T4BSS эволюционно связаны с прототипами типа IVA систем, которые посредничают передачи ДНК и может доставить ограниченный репертуар эффекторных белков, Dot / Icm система имеет почти в два раза больше компонентов машины и обеспечивает широкий спектр эффекторов. Предположительно, это расширение числа компонентов позволило Dot / Icm аппарат для размещения и интеграции новых эффекторов легко8,9.
Недавно мы использовали криоэлектронную томографию (крио-ET) для решения структуры дот-icm аппарата на месте и показали, что он образует клеточный конвертографический канал, который соединяется с цитоплазмическим комплексом. Дальнейший анализ показал, что цитосолико ATPase DotB ассоциируется с системой Dot/Icm на клеточном полюсе L. pneumophila через взаимодействие с цитосолическим ATPase DotO. Мы обнаружили, что DotB отображает цитозоликовое движение в большинстве бактериальных клеток, указывая, что это ATPase присутствует в динамической цитосолильной популяции, но также ассоциируется с полярными комплексами Dot/Icm. Кроме того, DotO образует гексамерную сборку димеров DotO, связанных с внутренним мембранным комплексом, и гексамер DotB присоединяется к основанию этого цитоплазмического комплекса. Сборка энергетического комплекса DotB-DotO создает цитоплазмический канал, который направляет транслокацию субстратов через T4SS(рисунок 1)10.
Несмотря на эти последние достижения, мало что известно о том, как работает система Dot/Icm и как каждый белок собирается, чтобы сформировать активный аппарат8. Раскрытие регулятивной схемы Dot/Icm T4SS имеет основополагающее значение для понимания молекулярных механизмов взаимодействия хоста и патогена. Поэтому мы обсуждаем, как использовать живую клеточную микроскопию и крио-ET для обнаружения и характеристики основных компонентов системы L. pneumophila Dot/Icm, которые помечены супер-папками GFP (sfGFP). Используя количественную флуоресценционную микроскопию, полярная локализация DotB будет определяться в фоновом режиме дикого типа или при удалении системы типа IV. Микроскопия замедленного времени будет использоваться для количественной оценки различий в локализации и динамике между цитосоликами AtPases Dot/Icm.
Комбинированное применение двух взаимодополняющих подходов, таких как живая визуализация и крио-ET, обеспечивает преимущество по сравнению с другими системами in vitro. Оба метода выполняются в нетронутых клетках и сохраняют естественную среду T4BSS, тем самым минимизируя нарушение родной структуры во время подготовки образца. Поскольку переэкспрессия белков может ухудшить стоихиометрию секреционного аппарата, слияние sfGFP возвращается через аллельский обмен на хромосому Legionella, так что каждый синтез закодирован в единственном экземпляре и выражение определяется эндогенным промоутером. Визуализация хромосомно закодированных слияний позволяет количественно определить точный уровень белка, выраженного в определенный момент времени. Cryo-ET также имеет много преимуществ для определения структуры систем секреции. Наиболее заметным преимуществом является то, что образцы крио-ET состоят из замороженных нетронутых клеток, которые сохраняют родные комплексы в контексте архитектуры бактериальных клеток. Следовательно, крио-ET может быть предпочтительнее биохимических подходов к очистке, которые извлекают мембранные комплексы и могут вывести периферийные белки из основного аппарата или изменять общую структуру. Кроме того, пометка белка интерес с громоздким белком, таким как sfGFP добавляет массу, которая обнаруживается крио-ET и может помочь с картированием различных подкомплексов dot/ Icm аппарата на структуру, полученную крио-ET.
Этот подход является мощным инструментом для раскрытия структурной информации о многомолекулярных комплексах, которые собираются в мембране бактериальных клеток. Интерпретация структур, разъясняемых с помощью этих методов, поможет полевому полю понять, как функционируют компоненты T4BSS, почему так много компонентов требуется для работы, как компоненты взаимодействуют в рамках большего комплекса и какие функции эти функции подсборки выполняют.
Protocol
Representative Results
Discussion
Выяснение функций бактериальных систем секреции является ключом к полному пониманию взаимодействия хозяина-патогена. Системы секретии являются сложными машинами, которые могут вводить эффекторы белков в клетки-хозяина, а в некоторых случаях способствовать созданию субклеточной ниш…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.C. и C.R.R. были поддержаны NIH (R37AI041699 и R21AI130671). D.P., B.H. и J.L. были поддержаны Национальными институтами здоровья (R01AI087946 и R01GM107629).
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
- Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).
- Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Isberg, R. R., O’Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
- Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
- Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires’ Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).
- Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
- Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
- Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
- Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
- Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).
- Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
- Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
- Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
- Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
- Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
- Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
