Inducera akut leverskada hos råttor via koltetraklorid (CCl4) Exponering genom en orogastric Tube
Summary
Detta protokoll beskriver en gemensam och genomförbar metod för att inducera akut leverskada (ALI) via CCl4 exponering genom en orogastric röret. CCl4 exponering inducerar ALI genom bildandet av reaktiva syrearter under dess biotransformation i levern. Denna metod används för att analysera patofysiologi ali och undersöka olika leverskyddande strategier.
Abstract
Akut leverskada (ALI) spelar en avgörande roll i utvecklingen av leversvikt, som kännetecknas av svår leverdysfunktion inklusive komplikationer såsom leverencefalopati och nedsatt proteinsyntes. Lämpliga djurmodeller är avgörande för att testa mekanismen och patofysiologi av ALI och undersöka olika leverskyddande strategier. På grund av dess förmåga att utföra kemiska transformationer används koltetraklorid (CCl4)ofta i levern för att inducera ALI genom bildandet av reaktiva syrearter. CCl4 exponering kan utföras intraperitoneally, genom inandning, eller genom en nasogastric eller orogastric röret. Här beskriver vi en gnagare modell, där ALI induceras av CCl4 exponering genom en orogastric röret. Denna metod är billig, lätt att utföra, och har minimal risk. Modellen är mycket reproducerbar och kan ofta användas för att bestämma effekten av potentiella leverskyddande strategier och bedöma markörer för leverskada.
Introduction
Frekvensen av giftiga förolämpningar mot levern, särskilt på grund av alkohol- och drogmissbruk, ökar. Akut leverskada (ALI) är förknippad med hög dödlighet och har orsakat kliniska problem1,2. Toxisk skada leder till död signalering vägar i levern, vilket resulterar i hepatocyte apoptos, nekros, eller pyroptos. ALI spelar en avgörande roll i utvecklingen av leversvikt, som kännetecknas av svår leverdysfunktion inklusive komplikationer såsom leverencefalopati och nedsatt proteinsyntes3,4. Även om ny forskning har ökat vår kunskap om de fysiologiska och patologiska förändringar som åtföljer lever misslyckande, har det inte helt förklarat patomolecular funktioner som påverkar mekanismerna för celldöd. Dessutom finns det för närvarande inga läkemedel för att vända den progressiva försämringen av ALI-patienter. För närvarande är den enda signifikant effektiv behandling levertransplantation5,6.
För att undersöka mekanismen och patofysiologin i ALI och för att testa olika leverskyddande strategier används olika djurmodeller för att inducera ALI. En bättre djurmodell av ALI bör efterlikna den patologiska processen av sjukdomen via en tillförlitlig, validerad, billig och lätt att tillämpa metod. Exempel på experimentella modeller är hepatotoxiska medel, kirurgiska ingrepp såsom fullständig eller partiell hepatectomy, fullständig eller övergående devascularization, och smittsamma förfaranden7,,8,9. Kända hepatotoxiska ämnen inkluderar galaktosamin, paracetamol, tioaanamid, azoxymetan och CCl4. Av dessa är CCl4 används i stor utsträckning även om det ännu inte har väl karakteriserats10,11,12,13.
CCl4 är en organisk färglös flytande förening med en söt lukt och nästan ingen brandfarlighet vid lägre temperaturer. Exponering för höga koncentrationer av CCl4 kan orsaka skador på centrala nervsystemet, inklusive försämring av lever och njurar. CCl4 inducerar ALI genom sin biotransformation i levern, som bildar reaktiva syrearter. Detta sker via P450 cytokromenzymet 2E1, som bildar en aktiv metabolit och resulterar i cellskador genom makromolekylbindning, förbättring av lipidperoxidation och störningar av intracellulär kalciumhomeostas14. Dessutom kan CCl4-modellen användas för att stimulera astrocyterna på RNA-syntesnivå15. Detta hepatotoxin har administrerats av intraperitoneal, intraportal, muntliga och intragastric rutter16.
I detta protokoll beskriver vi i detalj CCl4-induceradALI hos råttor via en orogastric röret. Denna metod inducerar robusta och reproducerbara ALI som kan användas för att undersöka patogenesen vid ALI. Bestämning av leversjukdom svårighetsgrad övervakas genom mätning av serum glutamat-pyruvat transaminase (GPT), glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) enzymer och totala bilirubin (TB) samt slutgiltig histologiska diagnos av hematoxylin och eosin (H & E) färgade levervävnader. Exponering för CCl4 genom intragastrisk åtkomst möjliggör en praktisk, billig, minimalt invasiv metod med minimal riskrisk.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll, CCl4 används som en lever toxin för att inducera ALI hos råttor. ALI kännetecknas av förlust av leverparenkym och efterföljande dysregulation av leverns metaboliska och syntetiska funktioner. Läkemedel, virus, toxiner, autoimmuna sjukdomar, metabola sjukdomar och kärlsjukdomar framkallar hepatocytedöd, och det efterföljande inflammatoriska svaret bidrar till patogenesen vid ALI.
Den första förolämpningen mot levern leder till cytokinproduktion, chemok…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner tacksamt Bertha Delgado, Institutionen för patologi, Soroka Medical Center, Fakulteten för hälsovetenskap, Ben-Gurion University of the Negev, för hennes hjälp i laboratoriet samt i histologi analys.
Materials
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma – Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma – Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
- Hoofnagle, J. H., Carithers, R. L., Shapiro, C., Ascher, N. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. Hepatology. 21 (1), 240-252 (1995).
- Rakela, J., Lange, S. M., Ludwig, J., Baldus, W. P. Fulminant hepatitis: Mayo clinic experience with 34 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (5), 289-292 (1985).
- Riordan, S. M., Williams, R. Treatment of hepatic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 337, 473-479 (1997).
- Bernuau, J., Rueff, B., Benhamou, J. Fulminant and subfulminant liver failure: Definitions and causes. Seminars in Liver Disease. 6 (2), 97-106 (1986).
- Lidofsky, S. D. Liver transplantation for fulminant hepatic failure. Gastroenterology Clinics of North America. 22 (2), 257-269 (1993).
- Auzinger, G., Wendon, J. Intensive care management of acute liver failure. Current opinion in critical care. 14 (2), 179-188 (2008).
- Wu, Q., et al. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Roles of mitochondrial uncoupling protein 2 and ATP stores. Digestive Diseases and Sciences. 54 (9), 1918-1925 (2009).
- Tuñón, M. J., Alvarez, M., Culebras, J. M., González-Gallego, J. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure. World Journal of Gastroenterologyl. 15 (25), 3086-3098 (2009).
- van de Kerkhove, M. P., Hoekstra, R., van Gulik, T. M., Chamuleau, R. A. Large animal models of fulminant hepatic failure in artificial and bioartificial liver support research. Biomaterials. 25 (9), 1613-1625 (2004).
- Butterworth, R. F., et al. Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver International. 29 (6), 783-788 (2009).
- Zhang, B., Gong, D., Mei, M. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Role of hepatic stimulator substance. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 14 (10), 1010-1017 (1999).
- Ugazio, G., Danni, O., Milillo, P., Burdino, E., Congiu, A. M. Mechanism of protection against carbon tetrachloride toxicity. I. prevention of lethal effects by partial surgical hepatectomy. Drug and Chemical Toxicology. 5 (2), 115-124 (1982).
- Taniguchi, M., Takeuchi, T., Nakatsuka, R., Watanabe, T., Sato, K. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride. Life Science. 75 (13), 1539-1549 (2004).
- Gordis, E. Lipid metabolites of carbon tetrachloride. Journal of Clinical Investigation. 48 (1), 203-209 (1969).
- Albrecht, J. Cerebral RNA synthesis in experimental hepatogenic encephalopathy. Journal of Neuroscience Research. 6 (4), 553-558 (1981).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36 (6), 770-774 (1991).
- Gruenbaum, B. F., et al. Cell-free DNA as a potential marker to predict carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Hepatology International. 7 (2), 721-727 (2013).
- Juricek, J., et al. Analytical evaluation of the clinical chemistry analyzer Olympus AU2700 plus. Biochemia Medica. 20 (3), 334-340 (2010).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Wang, T., et al. Protective effects of dehydrocavidine on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 117 (2), 300-308 (2008).
- Ye, X., et al. Hepatoprotective effects of coptidis rhizoma aqueous extract on carbon tetrachloride-induced acute liver hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 124 (1), 130-136 (2009).
- Wills, P. J., Asha, V. V. Protective effect of lygodium flexuosum (L.) sw. extract against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Journal of Ethnopharmacology. 108 (3), 320-326 (2006).
- Senior, J. R. Monitoring for hepatotoxicity: What is the predictive value of liver “function” tests. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (3), 331-334 (2009).
- Karmen, A. A note on the spectrometric assay of glutamic-oxalacetic transaminase in human blood serum. Journal of Clinical Investigation. 34 (1), 131-133 (1955).
- Hubner, G. Ultrastructural liver damage caused by direct action of carbon tetrachloride in vivo and in vitro. Virchows Archiv fur Pathologische Anatomie und Physiologie und fur Klinische Medizin. 339 (3), 187-197 (1965).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: A critical evaluation. Liver Transplantation. 6 (1), 21-31 (2000).
