Analyse av ikke-menneskelige primater bukspyttkjertel oksygenforbruk

Summary

Denne protokoll demonstrerer nøyaktig og reproduserbar måling av oksygen forbruket i ikke-menneskelige primater bukspyttkjertelen holmer. Holmen lasting teknikker og belegg av mikroplate gir et rammeverk for effektiv måling av åndedrett i andre typer kultivert spheroids.

Abstract

Måling av oksygen forbruket i spheroid klynger av celler, slik som ex vivo bukspyttkjertelen holmer, har historisk vært utfordrende. Vi viser måling av Holme oksygenforbruk ved hjelp av en 96-brønn mikroplate designet for måling av oksygen forbruket i spheroids. I denne analysen, spheroid mikroplater er belagt med en celle og vev lim på dagen før analysen. Vi bruker et lite volum av selvklebende løsning for å oppmuntre Holme tilslutning til bare bunnen av brønnen. På dagen for analysen, er 15 holmer lastet direkte inn i bunnen av hver brønn ved hjelp av en teknikk som sikrer optimal posisjonering av holmer og nøyaktig måling av oksygenforbruk. Ulike aspekter ved mitokondrie åndedrett er analysert farmakologisk i ikke-menneskelige primater holmer, inkludert ATP-avhengig åndedrett, maksimal åndedrett, og Proton lekkasje. Denne metoden gir konsistente, reproduserbar resultater med bare et lite antall holmer per brønn. Det kan teoretisk brukes til enhver kultivert spheroids av tilsvarende størrelse.

Introduction

For å opprettholde normale blodsukker nivåer må celle i bukspyttkjertelen føle økning i glukose og skille insulin tilsvarende. Koplingen av insulin sekresjon med glukose nivåer er direkte knyttet til glukose metabolisme og produksjonen av ATP gjennom mitokondrie oksidativt fosforylering. Dermed mitokondrier spille en avgjørende rolle i stimulans-sekresjon kopling¹. Vurdering av β-celle mitokondrie funksjon kan avdekke defekter som fører til nedsatt insulin sekresjon. Utskillelsen av glukagon av bukspyttkjertelen α-celler er også nært knyttet til mitokondrie funksjon². Selv om udødeliggjort Holme Cell Lines har vist seg nyttig for enkelte typer analyser, fysiologi av disse cellene ikke nøyaktig recapitulate hele Holme funksjon, som illustrert av potensiering av insulin sekresjon av glukagon^3,4 og hemming av glukagon sekresjon av insulin/somatostatin^5,6 i intakt holmer. Dette demonstrerer behovet for måling av oksygenforbruk ved bruk av hele, intakte holmer.

Teknikker for måling av holmen celle respirometry har utviklet seg over tid, fra bruk av oksygen-sensitive fluorescerende fargestoffer⁷ til solid-state sensorer som direkte måler oksygenforbruk⁸. Opprinnelig utviklet for monolag, tilhenger celler, brukte cellekultur plate systemer har vist seg å være ineffektiv for bukspyttkjertelen holmer. Som holmer ikke naturlig holder seg til brønnene, er de tilbøyelige til å bli skjøvet til periferien av kulturen godt resulterer i unøyaktig måling av oksygenforbruk⁹. For å bekjempe dette problemet, spesialiserte 24-brønn plater med en sentral depresjon som kan inneholde holmer ble utviklet⁹. Men 24-brønn plate systemet var begrenset av det store antallet holmer som kreves (50-80 per brønn) og antall forhold som kan testes samtidig¹⁰. Den nylige utviklingen av 96-brønn mikroplater utformet spesielt for ekstracellulære Flux analyse i spheroids har overvunnet disse barrierene, slik at måling av Holmen respirometry med 20 eller færre holmer per brønn¹⁰.

Her viser vi bruken av dette systemet til å måle oksygen forbruket i holmer fra den japanske macaque (Macaca fuscata), en dyremodell med lignende Holme Biology til mennesker^11,12. I denne protokollen analyseres 15 macaque holmer per brønn. I våre hender, 15 holmer per brønn produserte høyere Baseline oksygenforbruk enn færre holmer, med robust aktivering og undertrykkelse av åndedrett som svar på Pharmacologic manipulasjon. Vi fremhever fremgangsmåten for å forberede analysen, en effektiv metode for konsekvent lasting av holmer i sentrum av hver brønn, og felles utfordringer når du utfører denne analysen.

Protocol

1. utarbeidelse av Mikroplate og sensor patron på dagen før du kjører analysen Holmer ble isolert fra tre år gamle japanske aper som tidligere beskrevet13. Denne metoden er svært lik den som brukes til å isolere menneskelige holmer fra Cadaver donorer, men skiller seg fra mus, der pancreata er ofte oppblåst med kollagenase løsning mens dyret er under sedasjon og før organ fjerning. Islet henting ble gjennomført i samsvar med retningslinjene i den institusjonelle…

Representative Results

For å legge holmer i mikroplate bør 15 holmer pustende i 15 μL av medier, som vist i figur 1A. Holmer vil naturlig bosette seg mot bunnen av Pipet spissen i løpet av få sekunder. Deretter senkes Pipet spissen til bunnen av brønnen. Spissen er litt løftet, og et lite volum (ca. 5 μL) er Pipet tert ut sammen med holmer. Denne teknikken resulterer i konsekvent plassering av Holmen i bunnen av mikroplate brønn (figur…

Discussion

Studiet av Holmen oksygenforbruk har tidligere blitt hemmet av sfærisk form av holmer, deres mangel på overholdelse av kultur overflater, og antall holmer kreves per brønn. I denne protokollen fremhever vi effekten av 96-brønnen spheroid mikroplate for å måle Holme oksygenforbruk på et lite antall holmer og demonstrere en teknikk for håndtering og lasting av holmer som er teknisk gjennomførbart og gir konsistent Resultater.

For at holmer skal holde seg til bunnen av mikroplate og vær…

Materials

Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style	Corning	430166
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	Corning	354240
Conical tube, 50 mL	Falcon	352070
Dextrose anhydrous	Fisher Scientific	BP350-1	For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered
Disposable reservoirs (sterile), 25 ML	Vistalab	3054-1033	for loading multichannel pipet
EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm	Foxx Life Sciences	371-3115-OEM
L-glutamine	Gibco	25030-081	200 mM (100x)
Multichannel pipette tips	ThermoFisher Scientific	94410810
Multichannel pipette, 15-1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672100BT	Recommended
P20, P200, and P1000 pipettes	Eppendorf	2231000602
pH Probe	Hanna Instruments	HI2210-01
Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL	Olympus	24-404, 24-412, 24-430
Seahorse XF Base Media	Agilent	103334-100
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	S7800B	Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator
Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini	Agilent	102905-100	Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	BP328-500
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070	100 mM (100x)
Stereo Microscope	Olympus	SZX9
Syringe (sterile), 5 mL	BD	309603	For sterile filtration
Water (sterile)	Sigma	W3500-500mL