非人类灵长类动物胰腺胰岛耗氧量分析
Summary
该方案证明了对非人类灵长类胰腺胰岛中耗氧量的准确和可重复的测量。微孔板的压网加载技术和涂层为高效测量其他类型的培养球体中的呼吸提供了一个框架。
Abstract
测量细胞球体簇（如前体胰腺胰岛）的耗氧量历来具有挑战性。我们演示了使用 96 孔微孔板测量小岛耗氧量，该微孔板设计用于测量球体中的耗氧量。在此测定中，球形微孔板在测定前一天涂有细胞和组织粘合剂。我们利用少量的粘合剂溶液，鼓励小岛仅粘附在井底。在测定当天，使用确保胰岛最佳定位和准确测量耗氧量的技术，将15个胰岛直接装入每口井的底座。线粒体呼吸的各个方面在非人类灵长类动物的小岛中具有药理学，包括ATP依赖性呼吸、最大呼吸和质子泄漏。此方法允许使用每个孔仅少量的小岛获得一致、可重现的结果。理论上，它可以应用于任何大小相似的培养球体。
Introduction
为了保持正常的血糖水平，胰腺+细胞必须感知葡萄糖的升高并相应地分泌胰岛素。胰岛素分泌与葡萄糖水平的耦合与葡萄糖代谢和通过线粒体氧化磷酸化的ATP生产直接相关。因此，线粒体在刺激分泌耦合1中起着至关重要的作用。评估β-细胞线粒体功能可以揭示导致胰岛素分泌受损的缺陷。胰腺β细胞分泌胰高血糖素也与线粒体功能2密切相关。虽然不朽的胰岛细胞系已被证明对某些类型的检测有用，但这些细胞的生理学不能准确地重述整个胰岛功能，如胰高血糖素3、4和胰岛素/生菌素5、6在完整胰岛抑制胰岛素分泌的强效。这表明需要使用完整、完整的小岛测量耗氧量。
测量胰岛细胞再测量技术已经随着时间而发展，从使用氧敏荧光染料7到直接测量耗氧量的固态传感器8。最初为单层、粘附细胞设计，常用的细胞培养板系统已被证明对胰腺胰岛无效。由于小岛不自然地附着在井上，它们容易被推到培养井的边缘，导致对耗氧量的测量不准确9。为了解决这个问题，专门开发了24孔板，其中央凹陷，可以包含胰岛9。然而，24孔板系统受到需要大量的胰岛（每口50-80个）和可以同时测试10个条件的限制。最近开发96孔微孔板，专为球体细胞外通量分析设计，克服了这些障碍，使胰岛再测量每井10个或更少胰岛。
在这里，我们演示了使用这个系统来测量来自日本猴（马卡卡福斯卡塔）的小岛的耗氧量，这是一个动物模型，其生物学与人类相似11，12。在此协议中，每孔分析15个猴胰岛。在我们手中，每井15个小岛产生的基线耗氧量高于较少的小岛，具有强大的激活和抑制呼吸，以响应药理学操作。我们重点介绍准备测定的步骤、在每个井中心一致加载胰岛的有效方法，以及执行此测定时的常见挑战。
Protocol
Representative Results
Discussion
胰岛耗氧量的研究以前曾受到胰岛球形、对培养表面缺乏依从性以及每口井所需的胰岛数量的影响。在此协议中，我们重点介绍了 96 孔球形微孔板对测量小岛小岛耗氧量的功效，并演示了一种处理和装载胰岛的技术，该技术在技术上是可行的，并且产生一致的结果。
为了使胰岛粘附在微孔板的底部，在整个测定过程中在混合步骤中不受干扰，96 孔微孔板在测定前一天涂上细?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢范德比尔特高通量筛查核心使用他们的设施，安捷伦生物技术，保罗基辅博士（俄勒冈健康和科学大学）非人类灵长类动物小岛隔离，和埃里克多纳休（范德比尔特大学）协助图1。J.M.E.获得国家卫生研究院NIGMS的支持，奖励号为T32GM007347。M.G. 得到了 NIH/NIDDK （R24DK090964-06） 和退伍军人事务部 （BX003744） 的支持。
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
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