गैर-मानव रहनुमा अग्नाशय आइलेट ऑक्सीजन खपत का विश्लेषण
Summary
यह प्रोटोकॉल गैर-मानव रहनुमा अग्नाशय आइलेट्स में ऑक्सीजन की खपत के सटीक और प्रजनन योग्य माप को दर्शाता है। आइलेट लोडिंग तकनीक और माइक्रोप्लेट का कोटिंग अन्य प्रकार के सुसंस्कृत स्फेरॉइड में श्वसन के कुशल माप के लिए एक ढांचा प्रदान करता है।
Abstract
पूर्व वीवो अग्नाशय आइलेट्स जैसे कोशिकाओं के स्फेरॉइड समूहों में ऑक्सीजन की खपत का माप ऐतिहासिक रूप से चुनौतीपूर्ण रहा है। हम स्फेरॉइड में ऑक्सीजन की खपत के माप के लिए डिज़ाइन किए गए 96-अच्छी माइक्रोप्लेट का उपयोग करके आइलेट ऑक्सीजन की खपत की माप प्रदर्शित करते हैं। इस परख में, स्फेरॉइड माइक्रोप्लेटको परख से पहले दिन एक कोशिका और ऊतक चिपकने वाले के साथ लेपित किया जाता है। हम केवल कुएं के नीचे आइलेट के पालन को प्रोत्साहित करने के लिए चिपकने वाले समाधान की एक छोटी मात्रा का उपयोग करते हैं। परख के दिन, 15 आइलेट्स को सीधे एक तकनीक का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के आधार में लोड किया जाता है जो आइलेट्स की इष्टतम स्थिति और ऑक्सीजन की खपत के सटीक माप को सुनिश्चित करता है। माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन के विभिन्न पहलुओं की जांच गैर-मानव रहनुमा आइलेट्स में की जाती है, जिसमें एटीपी-निर्भर श्वसन, अधिकतम श्वसन और प्रोटोन रिसाव शामिल हैं। यह विधि केवल कम संख्या में आइलेट्स का उपयोग करके लगातार, प्रजनन योग्य परिणामों की अनुमति देती है। यह सैद्धांतिक रूप से इसी तरह के आकार के किसी भी सुसंस्कृत स्फेरॉइड पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
सामान्य रक्त शर्करा के स्तर को बनाए रखने के लिए, अग्नाशय की कोशिका को ग्लूकोज में ऊंचाई को समझना चाहिए और तदनुसार इंसुलिन को स्रावित करना चाहिए। ग्लूकोज के स्तर के साथ इंसुलिन स्राव का युग्मन सीधे ग्लूकोज मेटाबोलिज्म और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन के माध्यम से एटीपी के उत्पादन से जुड़ा हुआ है। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रिया उत्तेजना-स्राव युग्मन1में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कोशिका माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का आकलन करने से उन दोषों को प्रकट किया जा सकता है जो इंसुलिन स्राव को बाधित करते हैं। अग्नाशय की α कोशिकाओं द्वारा ग्लूकागन का स्राव भी माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन2से निकटता से बंधा हुआ है । हालांकि अमर आइलेट सेल लाइनों के कुछ प्रकार के रूपों के लिए उपयोगी साबित कर दिया है, इन कोशिकाओं के शरीर विज्ञान सही पूरे आइलेट समारोह संक्षिप्त नहीं है, के रूप में ग्लूकागन 3,4 द्वारा इंसुलिन स्राव के शक्तिशाली द्वारा सचित्र और इंसुलिन द्वारा ग्लूकागन स्राव के निषेध/ यह पूरे, बरकरार आइलेट्स का उपयोग कर ऑक्सीजन की खपत को मापने की आवश्यकता को दर्शाता है।
आइलेट सेल रेस्पिरोमेट्री की माप के लिए तकनीक समय के साथ विकसित हुई है, ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंटरंगों 7 के उपयोग से ठोस राज्य सेंसर ों तक जो सीधे ऑक्सीजन की खपत8को मापते हैं। शुरू में मोनोलेयर, अनुयायी कोशिकाओं के लिए डिज़ाइन किया गया है, आमतौर पर इस्तेमाल किया सेल संस्कृति प्लेट सिस्टम अग्नाशय आइलेट्स के लिए अप्रभावी साबित हुए हैं। चूंकि आइलेट्स स्वाभाविक रूप से कुओं का पालन नहीं करते हैं, इसलिए उन्हें संस्कृति की परिधि में धकेल दिए जाने का खतरा होता है जिसके परिणामस्वरूप ऑक्सीजन की खपत9का गलत माप होता है। इस समस्या का मुकाबला करने के लिए, एक केंद्रीय अवसाद के साथ विशेष 24-अच्छी तरह से प्लेटें जो आइलेट्स को शामिल कर सकतीथीं, 9विकसित की गई थीं। हालांकि, 24-अच्छी प्लेट प्रणाली बड़ी संख्या में आवश्यक आइलेट्स (50-80 प्रति अच्छी तरह से) और शर्तों की संख्या से सीमित थी जिसका परीक्षण एक साथ10किया जा सकता था। स्फेरॉइड में एक्स्ट्रासेलुलर फ्लक्स विश्लेषण के लिए विशेष रूप से डिजाइन किए गए 96-वेल माइक्रोप्लेट्स के हालिया विकास ने इन बाधाओं को दूर किया है, जिससे आइलेट रेस्पिरोमेट्री की माप को 20 या उससे कम आइलेट्स प्रति अच्छी तरह से10कर दिया गया है।
यहां, हम जापानी मकाक(मकाका फ्यूस्काटा)से आइलेट्स में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए इस प्रणाली के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं, जो मनुष्यों के लिए समान आइलेट जीव विज्ञान के साथ एक पशु मॉडल11,12। इस प्रोटोकॉल में, प्रति अच्छी तरह से 15 मकाक आइलेट्स का विश्लेषण किया जाता है। हमारे हाथों में, फार्माकोलॉजिक हेरफेर के जवाब में मजबूत सक्रियण और श्वसन के दमन के साथ, कम आइलेट्स की तुलना में उच्च बेसलाइन ऑक्सीजन खपत का उत्पादन करने वाले 15 आइलेट्स। हम परख के लिए तैयार करने के लिए कदम पर प्रकाश डाला, प्रत्येक अच्छी तरह से के केंद्र में islets के लगातार लोडिंग के लिए एक प्रभावी विधि है, और आम चुनौतियों जब इस परख प्रदर्शन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
आइलेट ऑक्सीजन की खपत का अध्ययन पहले आइलेट्स के गोलाकार आकार, संस्कृति सतहों के पालन की उनकी कमी और प्रति अच्छी तरह से आवश्यक आइलेट्स की संख्या से बाधित हुआ है । इस प्रोटोकॉल में, हम आइलेट्स की एक छोटी सं?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अपनी सुविधाओं के उपयोग के लिए वैंडरबिल्ट हाई थ्रूपुट स्क्रीनिंग कोर को स्वीकार करना चाहते हैं, गैर-मानव रहनुमा आइलेट आइसोलेशन के लिए डॉ पॉल कीविट (ओरेगन हेल्थ एंड साइंस यूनिवर्सिटी) और एरिक डोनाह्यू (वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय) चित्रा 1 के साथ सहायता के लिए। जेएमई को पुरस्कार संख्या T32GM007347 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के NIGMS द्वारा समर्थित किया गया था । एमजी NIH/NIDDK (R24DK090964-06) और दिग्गजों मामलों के विभाग (BX003744) द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
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