비인간 영장류 췌장 췌도 산소 소비 분석
Summary
이 프로토콜은 비인간 영장류 췌도에서 산소 소비의 정확하고 재현 가능한 측정을 보여줍니다. 마이크로플레이트의 아일렛 로딩 기술과 코팅은 다른 유형의 배양된 스페로이드에서 호흡을 효율적으로 측정할 수 있는 프레임워크를 제공합니다.
Abstract
전 생체 췌도와 같은 세포의 스페로이드 클러스터에서 산소 소비의 측정은 역사적으로 도전적이었습니다. 우리는 스페로이드의 산소 소비를 측정하기 위해 설계된 96 웰 마이크로 플레이트를 사용하여 아일렛 산소 소비의 측정을 보여줍니다. 이 분석에서, 스페로이드 마이크로 플레이트는 분석 전날 세포 및 조직 접착제로 코팅된다. 우리는 소량의 접착제 용액을 사용하여 우물의 바닥만에 대한 밑면 준수를 장려합니다. 분석 당일, 15개의 작은 섬은 최적의 섬 위치와 산소 소비의 정확한 측정을 보장하는 기술을 사용하여 각 우물의 기지에 직접 로드됩니다. 미토콘드리아 호흡의 다양한 측면은 ATP 의존호흡, 최대 호흡 및 양성자 누출을 포함한 비인간 영장류 아일에서 약리학적으로 조사됩니다. 이 방법을 사용하면 웰당 소수의 섬만 사용하여 일관되고 재현 가능한 결과를 볼 수 있습니다. 이론적으로 비슷한 크기의 배양 된 스페로이드에 적용 될 수 있습니다.
Introduction
정상적인 혈당 수준을 유지하기 위해 췌장 β 세포는 포도당의 고도를 감지하고 그에 따라 인슐린을 분비해야합니다. 포도 당 수준과 인슐린 분 비의 결합은 직접 포도 당 물질 대사와 미토 콘 드리 아 산화 인 산화를 통해 ATP의 생산에 연결. 따라서, 미토콘드리아는 자극 분비 커플링1에서중요한 역할을 한다. β 세포 미토콘드리아 기능을 평가하는 것은 손상한 인슐린 분비로 이끌어 내는 결점을 드러낼 수 있습니다. 췌장 α 세포에 의한 글루카곤의 분비는 또한 미토콘드리아 기능2와밀접하게 연관되어 있다. 불멸의 섬 세포주가 일부 유형의 분석에 유용하다는 것이 입증되었지만, 이들 세포의 생리학은 글루카곤3,4에 의한 인슐린 분비의 전위및 인슐린/소마토스타틴5,6에 의한 글루카곤 분비의 억제에 의해 예시된 바와 같이 전체 섬 기능을 정확하게 회귀하지 는 않는다. 이것은 전체, 그대로 섬을 사용하여 산소 소비를 측정할 필요성을 보여줍니다.
아일렛 세포 호흡측정기 의 측정 기술은 산소에 민감한 형광 염료7의 사용에서 산소 소비를 직접 측정하는 고체 센서에 이르기까지 시간이 지남에 따라 진화해 왔으며8. 처음에 단층, 부착 세포를 위해 설계, 일반적으로 사용되는 세포 배양 플레이트 시스템은 췌장 섬에 효과가 입증되었습니다. 작은 섬이 자연적으로 우물에 부착되지 않기 때문에, 그들은 잘 산소 소비의 부정확한 측정의 결과로 배양의 주변에 밀려되는 경향이있다 9. 이 문제에 대처하기 위해, 섬을 포함 할 수있는 중앙 우울증과 전문 24 웰플레이트는 9개발되었다 . 그러나, 24웰 플레이트 시스템은 필요한 많은 수의 섬들(웰당 50-80)과 동시에10개까지시험될 수 있는 조건의 수에 의해 제한되었다. 최근 스페로이드의 세포외 플럭스 분석을 위해 특별히 설계된 96웰 마이크로플레이트의 개발은 이러한 장벽을 극복하여 웰10당20개 이하의 섬으로 섬 호흡을 측정할 수 있게 되었습니다.
여기서, 우리는 일본 원숭이(마카카 fuscata),인간과유사한 섬 생물학을 가진 동물 모델에서 작은 섬에서 산소 소비를 측정하기 위해이 시스템의 사용을 보여줍니다11,12. 이 프로토콜에서는 15개의 마카크 섬을 웰당 분석합니다. 우리의 손에, 잘 생산 당 15 작은 섬 적은 섬 보다 더 높은 기준선 산소 소비, 강력한 활성화 및 약리학 조작에 대 한 응답에 호흡의 억압. 우리는 분석, 각 우물의 중심에 작은 섬을 일관되게 로딩하기위한 효과적인 방법, 이 분석법을 수행 할 때 일반적인 도전을 준비하는 단계를 강조한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
섬 산소 소비의 연구는 이전에 작은 섬의 구형 모양에 의해 방해되었습니다, 배양 표면에 대한 준수의 부족, 그리고 잘 당 필요한 섬의 수. 이 프로토콜에서는 소수의 섬에 대한 섬 산소 소비를 측정하기 위한 96웰 스페로이드 마이크로플레이트의 효능을 강조하고 기술적으로 실현 가능하고 일관된 섬을 취급하고 적재하는 기술을 시연합니다. 결과.
작은 섬이 마이크로 플레이…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그들의 시설의 사용에 대한 밴더빌트 높은 처리량 스크리닝 코어를 인정하고 싶습니다, 애질런트 생명 공학, 박사 폴 Kievit (오리건 건강 과학 대학) 비 인간 영장류 고립에 대한, 에릭 Donahue (밴더빌트 대학) 그림 에 대한 도움 1. J.M.E.는 수상 번호 T32GM007347에서 건강의 국가 학회의 NIGMS에 의해 지원되었습니다. M.G.는 NIH/NIDDK(R24DK090964-06)와 재향군인회(BX003744)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
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