הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח
Summary
כאן, אנו מציגים שיטת הקרנה שונה שניתן להשתמש בהרחבה כדי להקרין במהירות RNA השתקה דכאי במחלות צמחים.
Abstract
רנ א השתקה הוא שימור אבולוציונית, רצף ספציפי מנגנון רגולציה הגנים ב eukaryotes. פתוגנים צמחים מספר התפתחו חלבונים עם היכולת לעכב את המפעל מארח RNA השתקה המסלול. שלא כמו חלבונים אפקטור וירוס, רק מספר חלבונים אפקטור מופרש הראו את היכולת לדכא RNA השתקה בקטריאלי, o, ופטריות ופתוגנים, ואת הפונקציות המולקולריות של רוב העריקים להישאר ידועים ברובו. כאן, אנו מתארים בפרוטרוט גרסה שונה מעט של השינוי החדירה שיתוף שיכול לשמש כשיטה כללית להתבוננות RNA השתקה ולאפיון חלבונים אפקטור מופרש על ידי פתוגנים צמחים. השלבים העיקריים של הגישה הם בחירת העלים בריאים ומפותחים באופן מלא, התאמת התרבות חיידקים לדחיסות אופטית המתאימה (OD) ב 600 ננומטר, והתבוננות חלבון פלורסנט ירוק (GFP) זריחה בזמן האופטימלי על החדר המתאים העלים על מנת למנוע השמטת עריקים בפעילות דיכוי חלשה. פרוטוקול משופר זה יתרום מהירה, מדויקת, הקרנה נרחבת של RNA השתקה דכאי ולשמש נקודת התחלה מצוינת לחקירת פונקציות מולקולריות של חלבונים אלה.
Introduction
במהלך שני העשורים האחרונים, האצת רצף הגנום של מיקרואורגניזמים הגורמות מחלות צמחים הוביל פער ידע הולך וגובר בין מידע רצף ופונקציות ביולוגיות של חלבונים מקודד1. בין המולקולות שנחשפו על-ידי פרויקטים ברצף הם מולקולות אפקטור לדכא חסינות מולדת ולהקל על הקולוניזציה המארחת; גורמים אלה מופרשים על ידי פתוגנים צמחים הרסניים, כולל חיידקים, nematodes, וחיידקים filamentous. כדי להגיב על איומים אלה, צמחים מארחים התפתחו קולטני הרומן המכירים את העריקים האלה, המאפשרים שחזור של התגובה החיסונית. מכאן, העריקים כפופים ללחצים סלקטיבית שונים, המוביל לגיוון של אפקטור repertoires בקרב הפתוגן שנים2. בשנים האחרונות, מנטרל מפתוגנים צמחים הוכחו לשבש הצמח חסינות מולדים על ידי הפרעה תהליכים סלולריים מארח לטובת חיידקים במגוון דרכים, כולל דיסרגולציה של איתות מסלולים, תמלול, הובלה תאיים, יציבות השלד, שלפוחית הסחר, ו RNA השתקה3,4,5. עם זאת, הרוב המכריע של העריקים הפתוגן, במיוחד אלה של פתוגנים filamentous, נותרו מחוחימים.
רנ א השתקה היא הומולוגיה-בתיווך גן מכונות ההפעלה כי הוא שימור בין eukaryotes. התהליך מופעל על ידי ארוך כפול תקועים RNA (dsRNA) ומטרות RNA הומוולוגי יחיד תקוע (ssRNA) באופן ספציפי רצף, והיא מפעילה מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל הגנה אנטי ויראליות6. כדי להתגבר על התגובות החיסונית הטבועה של המארח, וירוסים מסוימים התפתחו לקזז RNA השתקה, כולל היכולת לשכפל בתוך התאים תאיים או לברוח מהאות מאורגן מראש. אף על פי כן, האסטרטגיה הכללית ביותר שבה וירוסים להגן על גנום שלהם נגד rna השתקה תלוי אובדן של הפונקציה gene היא לקודד חלבונים ספציפיים לדכא rna השתקה7,8. מספר גישות שונות של מכניזיות הוקמו על המסך ואיפיון דכאי ויראלי של RNA השתקה (vsrs), כולל הסתננות של agrobacterium התרבויות tumefaciens , צמחים טרנסגניים להביע דכאי, השתלה ותרבות התא9,10,11,12,13.
לכל אחד מאותם מספר יש יתרונות וחסרונות, ומזהה VSRs באופן ייחודי משלו. אחת הגישות הנפוצות ביותר מבוססת על חדירה משותפת של הפרט A. tמואfaciens תרבויות מחסה את החלבון הנגיפי הפוטנציאלי גן עיתונאי (בדרך כלל חלבון פלורסנט ירוק [gfp]) על טבק benthamiana 16c צמחים ביטוי המבטא gfp תחת השליטה של וירוס פסיפס כרובית של מקדם 35. בהעדר משתיק קול ויראלי פעיל, GFP מזוהה כאקסוגני על ידי התאים המארחים והוא מושתק בתוך 3 ימים לאחר הסתננות (dpi). לעומת זאת, אם החלבון הנגיפי מחזיק בפעילות הדיכוי, רמת הביטוי של GFP נותרת יציבה מעבר ל -3 עד 9 dpi9. שיתוף החדירה המשותף הזה הוא פשוט ומהיר; עם זאת, הוא לא יציב מאוד ולא רגיש. עם זאת, את השיטת זיהה vsrs רבים עם רצפי חלבון מגוונים ומבנים רבים RNA וירוסים7,8.
לאחרונה, כמה חלבונים אפקטור שיכולים לעכב את הפעילות התאית השתקה הסלולר כבר מאופיין חיידקי, o, ופטריות צמח פתוגנים14,15,16. ממצאים אלה משתמע כי רנ א השתקה הדיכוי היא אסטרטגיה נפוצה להקלה על זיהום המשמש פתוגנים ברוב הממלכות. בתאוריה, רבים, אם לא כולם, של העריקים עשויים לקודד RNA השתקה דכאי (RSSs); עד כה, לעומת זאת, רק מעטים זוהו, בעיקר בשל המחסור באסטרטגיית ההקרנה האמינה והכללית. יתר על כן, דכאי של RNA השתקה לא נחקרו ברוב המכריע של פתוגנים צמחים17.
בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול ממוטב וכללי לזיהוי הפתוגן הגורם למחלה שיכול לדכא RNA מקומי ומערכתי השתקה באמצעות שיטת החדירה אגרו. המטרה הראשונה של מחקר זה הייתה להדגיש את ההיבטים המרכזיים של הפרוטוקול ולתאר את השלבים בפרוטרוט, ובכך לספק מבחן הקרנה המתאים לכמעט כל העריקים של פתוגנים צמחיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
רנ א השתקה הוא מנגנון הגנה מפתח המועסקים על ידי צמחים להילחם ויראלי, חיידקי, o, ופתוגנים פטרייתי. בתורו, החיידקים האלה התפתחו חלבונים מדכא השתקה כדי לנטרל נגיפים השתקה, ואת אלה RSSs להפריע לשלבים שונים של השביל השתקה RNA22,23. כמה הקרנת ההקרנה פותחו כדי לזהות RSSs<sup cl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים של “שואנג תוכנית” של קרן לפיתוח החינוך שנגחאי הנציבות העירונית של שנגחאי ועדת החינוך העירוני, מחקר המפתח הלאומי תוכנית פיתוח של סין המפתח הלאומי R & D תוכנית של סין ( 2018YFD0201500), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (no. 31571696 ו 31660510), התוכנית אלף כשרונות עבור אנשי מקצוע צעירים של סין, ואת הנציבות המדע והטכנולוגיה של עיריית שנגחאי (18DZ2260500).
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
- Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
- Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
- Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
- Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
- Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
- Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
- Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
- Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
- Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
- Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).
- Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
- Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
- Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
- Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).
