Screening e identificazione dei soppressori del silenziamento dell'RNA da parte degli effetti segreti dei patogeni vegetali
Summary
Qui, presentiamo un metodo di screening modificato che può essere ampiamente utilizzato per vagliare rapidamente i soppressori del silenziamento dell’RNA negli agenti patogeni delle piante.
Abstract
Il silenziamento dell’RNA è un meccanismo di regolazione genica evolutivamente conservato e specifico della sequenza negli eucarioti. Diversi patogeni delle piante hanno sviluppato proteine con la capacità di inibire il percorso di silenziamento dell’RNA vegetale ospite. A differenza delle proteine degli efmarcatori di virus, solo diverse proteine degli effetti secreti hanno mostrato la capacità di sopprimere il silenziamento dell’RNA nei patogeni batterici, oomycete e fungini, e le funzioni molecolari della maggior parte degli effetti rimangono in gran parte sconosciute. Qui, descriviamo in dettaglio una versione leggermente modificata del saggio di co-infiltrazione che potrebbe servire come metodo generale per osservare il silenziamento dell’RNA e per caratterizzare le proteine efsiate secrete dagli agenti patogeni delle piante. I passi chiave dell’approccio sono la scelta delle foglie sane e completamente sviluppate, l’adattamento della coltura batterica alla densità ottica appropriata (OD) a 600 nm e l’osservazione della fluorescenza delle proteine fluorescenti verdi (GFP) al momento ottimale sull’infiltrato per evitare di omettere effettori con debole attività di soppressione. Questo protocollo migliorato contribuirà a uno screening rapido, accurato ed approfondito dei soppressori per il silenziamento dell’RNA e servirà come un ottimo punto di partenza per studiare le funzioni molecolari di queste proteine.
Introduction
Negli ultimi due decenni, l’accelerazione nel sequenziamento del genoma dei microrganismi che causano le malattie delle piante ha portato ad un divario di conoscenza sempre crescente tra le informazioni di sequenza e le funzioni biologiche delle proteine codificate1. Tra le molecole rivelate dai progetti di sequenziamento ci sono molecole echeggianti che sopprimono l’immunità innata e facilitano la colonizzazione dell’ospite; questi fattori sono secreti da patogeni vegetali distruttivi, tra cui batteri, nematodi e microbi filamentosi. Per rispondere a queste minacce, le piante ospiti hanno sviluppato nuovi recettori che riconoscono questi effetti, consentendo il ripristino della risposta immunitaria. Pertanto, gli esetritori sono soggetti a varie pressioni selettive, che portano alla diversificazione dei repertori degli efreattori tra le linee patogene2. Negli ultimi anni, gli effetti putativi da agenti patogeni vegetali hanno dimostrato di interrompere l’immunità innata delle piante impedendo i processi cellulari dell’ospite a beneficio dei microbi in una varietà di modi, tra cui la disregolazione delle vie di segnalazione, la trascrizione, il trasporto intracellulare, la stabilità del citoscheletro, il traffico di vescicoli e la messa a tacere dell’RNA3,4,5. Tuttavia, la stragrande maggioranza degli effetti patogeni, in particolare quelli provenienti da patogeni filamentosi, sono rimasti enigmatici.
Il silenziamento dell’RNA è un meccanismo di inattivazione genica mediato dall’omologia che viene conservato tra gli eucarioti. Il processo è innescato da un lungo RNA a doppio filamento (dsRNA) e si rivolge all’RNA omologato a filamento singolo (ssRNA) in modo specifico della sequenza e manipola un’ampia gamma di processi biologici, compresa la difesa antivirale6. Per superare le risposte immunitarie innate dell’ospite, alcuni virus si sono evoluti per compensare il silenziamento dell’RNA, inclusa la capacità di replicarsi all’interno di compartimenti intracellulari o fuggire dal segnale riorganizzato del silenziamento. Tuttavia, la strategia più generale con cui i virus proteggono i loro genomi dalla perdita dipendente dal silenziamento dell’RNA della funzione genica è codificare proteine specifiche che sopprimono il silenziamento dell’RNA7,8. Diversi approcci meccanicistici sono stati stabiliti per vagliare e caratterizzare i soppressori virali del silenziamento dell’RNA (VSR), tra cui la co-infiltrazione delle colture di Agrobacterium tumefaciens, piante transgeniche che esprimono soppressori putativi, innesto e coltura cellulare9,10,11,12,13.
Ognuno di questi saggi ha vantaggi e svantaggi, e identifica VSR in modo proprio. Uno degli approcci più comuni si basa sulla co-infiltrazione delle singole colture A. tmuefaciens che ospitano la potenziale proteina virale e un gene reporter (tipicamente proteina fluorescente verde [GFP]) sulle piante di Nicotiana benthamiana 16c che esprimono costituitamente GFP sotto il controllo del virus del mosaico del caulfiore 35Sr. In assenza di un soppressore attivo del silenziamento virale, la GFP viene identificata come esogena dalle cellule ospiti e viene silenziata entro 3 giorni dopo l’infiltrazione (dpi). Al contrario, se la proteina virale possiede un’attività di soppressione, il livello di espressione della GFP rimane costante oltre i 3,9 dpi9. Questo saggio di co-infiltrazione è semplice e veloce; tuttavia, non è né altamente stabile né sensibile. Ciò nonostante, il saggio ha identificato numerosi VSR con diverse sequenze proteiche e strutture in molti virus dell’RNA7,8.
Recentemente, diverse proteine eftraenti che possono inibire l’attività di silenziamento dell’RNA cellulare sono state caratterizzate da patogeni batterici, oomycete e piante fungine14,15,16. Questi risultati implicano che la soppressione del silenziamento dell’RNA è una strategia comune per facilitare l’infezione che viene utilizzata dagli agenti patogeni nella maggior parte dei regni. In teoria, molti, se non tutti, degli effetti potrebbero codificare soppressori del silenziamento dell’RNA (RSS); ad oggi, tuttavia, solo alcuni sono stati individuati, principalmente a causa della carenza della strategia di screening affidabile e generale. Inoltre, i soppressori del silenziamento dell’RNA non sono stati studiati nella stragrande maggioranza degli agenti patogeni delle piante17.
In questa relazione, presentiamo un protocollo ottimizzato e generale per identificare gli effetti patogeni delle piante che possono sopprimere il silenziamento dell’RNA locale e sistemico utilizzando il saggio di agroinfiltrazione. L’obiettivo principale di questo studio era quello di enfatizzare gli aspetti chiave del protocollo e descrivere i passaggi in dettaglio, fornendo così un saggio di screening che è adatto a quasi tutti gli effetti degli agenti patogeni vegetali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il silenziamento dell’RNA è un meccanismo di difesa chiave impiegato dalle piante per combattere agenti patogeni virali, batterici, oomycete e fungini. A loro volta, questi microbi hanno sviluppato proteine soppressori silenziamento per contrastare il silenziamento antivirale, e questi RSS interferiscono con diversi passaggi del percorso di silenziamento dell’RNA22,23. Sono stati sviluppati diversi saggi di screening per identificare gli RSS10<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del “Programma Shuguang” della Shanghai Education Development Foundation e della Shanghai Municipal Education Commission, del National Key Research and Development Program of China National Key R&D Program of China ( 2018YFD0201500), la National Natural Science Foundation of China (n. 31571696 e 31660510), il Thousand Talents Program for Young Talents of China e la Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18D-2260500).
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
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