植物病原体の分泌されたエフェクターからのRNAサイレンシング抑制剤のスクリーニングと同定
Summary
ここでは、植物病原体のRNAサイレンシング抑制剤を迅速にスクリーニングするために広く使用できる改変スクリーニング方法を紹介する。
Abstract
RNAサイレンシングは、真核生物における進化的に保存された配列特異的遺伝子調節機構です。いくつかの植物病原体は、宿主植物RNAサイレンシング経路を阻害する能力を持つタンパク質を進化させた。ウイルスエフェクタータンパク質とは異なり、細菌、ウーミセテ、真菌病原体のRNAサイレンシングを抑制する能力を示したのは、分泌されたエフェクタータンパク質の数個のみであり、ほとんどのエフェクターの分子機能はほとんど知られていない。ここでは、RNAサイレンシングを観察する一般的な方法として役立つ可能性のあるCo-浸潤アッセイのわずかに改変されたバージョンと、植物病原体によって分泌されるエフェクタータンパク質の特徴付けについて詳しく説明します。このアプローチの重要なステップは、健康で完全に発達した葉を選択し、細菌培養を600nmで適切な光学密度(OD)に調整し、浸潤した最適な時間に蛍光タンパク質(GFP)蛍光を観察することです。抑制活性が弱いエフェクターを省略することを避けるために葉。この改良されたプロトコルは、RNAサイレンシング抑制剤の迅速かつ正確かつ広範なスクリーニングに寄与し、これらのタンパク質の分子機能を調べるための優れた出発点として役立ちます。
Introduction
過去20年間、植物疾患を引き起こす微生物のゲノムシーケンシングの加速は、配列情報とコード化タンパク質の生物学的機能との間の知識格差の増加につながっている1。シーケンシングプロジェクトによって明らかにされた分子の中には、自然免疫を抑制し、宿主のコロニー形成を促進するエフェクター分子があります。これらの因子は、細菌、線虫、糸状微生物を含む破壊的な植物病原体によって分泌される。これらの脅威に対応するために、宿主植物はこれらのエフェクターを認識する新しい受容体を進化させたので、免疫応答の回復が可能になりました。したがって、エフェクターは様々な選択的圧力を受け、病原体系統2間のエフェクターレパートリーの多様化を招く。近年、植物病原体からの推定エフェクターは、シグナル伝達経路の調節制御、転写、細胞内輸送、細胞骨格安定性、小胞の密転、およびRNAサイレンシング3、4、5を含む様々な方法で微生物に利益をもたらす宿主細胞プロセスを妨げることによって、植物の先天性免疫を破壊することが示されている。しかし、大多数の病原体のエフェクター、特に糸状病原体のエフェクターは、謎めいたままである。
RNAサイレンシングは、真核生物の間で保存されている相同性媒介性遺伝子不活性化機械です。このプロセスは、長い二本鎖RNA(dsRNA)によって引き起こされ、相同の一本鎖RNA(ssRNA)を配列特異的に標的とし、抗ウイルス防御6を含む幅広い生物学的プロセスを操作する。宿主の自然免疫応答を乗り越えるために、一部のウイルスは、細胞内コンパートメント内で複製したり、サイレンシング再編成されたシグナルから脱出したりする能力を含むRNAサイレンシングを相殺するために進化した。それにもかかわらず、ウイルスがRNAサイレンシング依存性遺伝子機能の喪失からゲノムを保護する最も一般的な戦略は、RNAサイレンシング7、8を抑制する特定のタンパク質をコードすることです。いくつかの機械学的に異なるアプローチが確立され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス培養物の共浸潤、推定サプレッサーを発現するトランスジェニック植物、グラフトおよび細胞培養9、10、11、12、13のウイルス抑制剤(VSR)をスクリーニングし、特徴付けされている。
これらのアッセイには、それぞれ長所と短所があり、VSRを独自の方法で識別します。最も一般的なアプローチの1つは、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの制御下でGFPを構成的に発現するニコチアナベンタミアナ16c植物上の潜在的なウイルスタンパク質およびレポーター遺伝子(典型的には緑色蛍光タンパク質[GFP])を収容する個々のA.tmuefaciens培養物の共浸透に基づいている。アクティブなウイルスサイレンシング抑制剤がない場合、GFPは宿主細胞によって外因性として同定され、浸潤後3日以内に無音(dpi)される。これに対して、ウイルスタンパク質が抑制活性を有する場合、GFPの発現量は3−9dpi9を超えて安定したままである。この共浸透アッセイは、シンプルかつ高速です。ただし、安定性も高い感度も低いわけではありません。それにもかかわらず、アッセイは、多くのRNAウイルス7、8において多様なタンパク質配列および構造を有する多数のVsRを同定した。
近年、細胞RNAサイレンシング活性を阻害し得るいくつかのエフェクタータンパク質は、細菌、ウーミセテ、および真菌性植物病原体14、15、16から特徴付けられている。これらの知見は、RNAサイレンシング抑制がほとんどの王国の病原体によって使用される感染を促進するための一般的な戦略であることを示唆している。理論的には、エフェクターの多くは、すべてではないにしても、RNAサイレンシング抑制剤(RSS)をコードする可能性があります。しかし、現在までに、信頼できる一般的なスクリーニング戦略の不足のために、少数しか特定されていません。また、植物病原体17の大半では、RNAサイレンシングの抑制剤は調査されていない。
本報告では、農潤浸潤アッセイを用いて局所的および全身的なRNAサイレンシングを抑制できる植物病原体エフェクターを同定するための最適化された一般的なプロトコルを提示する。この研究の最も重要な目的は、プロトコルの重要な側面を強調し、そのステップを詳細に記述し、それによって植物病原体のほぼすべてのエフェクターに適したスクリーニングアッセイを提供することであった。
Protocol
Representative Results
Discussion
RNAサイレンシングは、ウイルス、細菌、ウーミセテ、真菌病原体と闘うために植物によって採用される重要な防御機構です。次に、これらの微生物は、抗ウイルスサイレンシングを打ち消すためにサイレンシング抑制タンパク質を進化させ、そしてこれらのRSSは、RNAサイレンシング経路22、23の異なるステップを妨害する。RSS10を?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、上海教育開発財団の「秀光プログラム」と中国国家主要研究開発プログラム(中国国家主要研究開発プログラム)からの助成金によって支えられました(2018YFD0201500)、中国国立自然科学財団(No.31571696および31660510)、中国の若手専門家のための千人の才能プログラム、上海市科学技術委員会(18DZ2260500)。
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
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